Salgının erken aşamasında, hızlı gelişme nedeniyle şüpheli hastaların hızlı teşhisi, COVID-19'u önlemenin anahtarıdır.Bazı onaylı nükleik asit saptama reaktiflerinin kısa bir geliştirme süresi vardır ve acele performans onayı, yetersiz reaktif optimizasyonu ve partiler arasında büyük farklar gibi sorunlar vardır;Çeşitli klinik laboratuvarların nükleik asit saptama işleminin çeşitli yönlerindeki sorunları da nükleik asit saptama sonuçlarının doğruluğunu etkileyebilir.Bu makale, mevcut SARS-CoV-2 nükleik asit saptamasındaki temel bağlantılara ve noktalara odaklanacak ve laboratuvar nükleik asit saptamasının yanlış negatif ve pozitif yeniden incelenmesi ve klinik tutarsızlık sorunlarını analiz edecektir.

SARS-CoV-2 nükleik asit saptama ilkeleri

SARS-CoV-2, 10 proteini etkili bir şekilde kodlayabilen, 10 gene sahip, yaklaşık 29 kb'lik bir genom dizisine sahip bir RNA virüsüdür.Virüsler, RNA ve proteinden oluşur ve en dıştaki tabaka, lipitler ve glikoproteinlerden oluşan bir dış kaplamadır.İçeride, protein kapsid, içindeki RNA'yı sarar, böylece kolayca parçalanabilen RNA'yı (P1) korur.

SARS-COV-2'nin P1 Yapısı

Virüsler, enfeksiyona neden olmak için belirli hücre yüzeyi reseptörleri yoluyla hücreleri istila eder ve çoğalmak için konakçı hücreleri kullanır.

Viral nükleik asit tespitinin prensibi, viral RNA'yı bir hücre lizatı yoluyla açığa çıkarmak ve ardından tespit için gerçek zamanlı floresan ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanmaktır.

Tespit ilkesinin anahtarı, nükleik asit dizilerinin "hedefli eşleşmesini" elde etmek, yani yaklaşık 30.000 bazda (nükleik asidin diğer virüslere benzerliği) "Düşük" alan) diğer virüslerden farklı olan SARS-CoV-2'nin nükleik asit dizisini bulmak için primerler ve problar kullanmaktır.

Primerler ve problar, SARS-CoV-2 nükleik asidin spesifik bölgesi ile yüksek oranda uyumludur, yani özgüllük çok güçlüdür.Test edilecek numunenin gerçek zamanlı floresan RT-PCR amplifikasyon sonucunun pozitif çıkması, numunede SARS-CoV-2'nin bulunduğunu kanıtlar.P2'ye bakın.

P2 SARS-CoV-2 nükleik asit tayininin Adımları (gerçek zamanlı floresan RT-PCR)

SARS-CoV-2 nükleik asit tespiti için laboratuvar koşulları ve gereklilikleri

Nükleik asit test laboratuvarları, negatif basınçlı ortamlar için en idealdir ve basınç izlemeye dikkat etmeli, hava akışını sağlamalı ve aerosolleri ortadan kaldırmalıdır.Nükleik asit test personeli ilgili niteliklere sahip olmalı, ilgili polimeraz zincir reaksiyonu eğitimi almalı ve değerlendirmeyi geçmelidir.Laboratuvar sıkı bir şekilde yönetilmeli, bölgelere ayrılmalı ve alakasız personelin girmesi kesinlikle yasaktır.Temiz alan havalandırılmalı ve yerinde dezenfekte edilmelidir.İlgili eşyalar bölgelere yerleştirilir, temiz ve kirli ayrılır, zamanında değiştirilir ve yerinde dekontamine edilir.Rutin dezenfeksiyon: Büyük alanlar için klor içeren dezenfektan ana çözümdür ve küçük alanlar için %75 alkol kullanılabilir.Aerosollerle baş etmenin iyi bir yolu havalandırma için pencereleri açmaktır ve hava dezenfeksiyonu ultraviyole ışınları, filtrasyon ve hava dezenfeksiyonu yoluyla da gerçekleştirilebilir.

SARS-CoV-2 nükleik asit tayininin (gerçek zamanlı floresan RT-PCR) temel bağlantıları ve parametreleri

Laboratuvarlar genellikle nükleik asit "tespitine" çok dikkat etseler de, aslında nükleik asit "ekstraksiyonu" da virüs numunelerinin toplanması ve saklanması ile yakından ilgili olan başarılı tespit için kilit adımlardan biridir.

Şu anda, nazofaringeal sürüntüler gibi en yaygın kullanılan solunum numuneleri, nükleik asit ekstraksiyonu ve lizis solüsyonuna dayalı olarak hazırlanan bir inaktivasyon (koruma) solüsyonu olan ikinci yöntemi kullanır.Bir yandan, bu virüs koruma çözümü virüsün proteinini denatüre edebilir, aktivitesini kaybedebilir ve artık bulaşıcı olmayabilir ve taşıma ve tespit aşamasının güvenliğini iyileştirebilir;Öte yandan, nükleik asidi serbest bırakmak, nükleik asit ayrıştırıcı enzimi ortadan kaldırmak ve virüsü önlemek için virüsü doğrudan kırabilir.RNA bozulur.

Nükleik asit ekstraksiyon lizis solüsyonu bazında hazırlanmış bir virüs örnekleme solüsyonu.Ana bileşenler, dengeli tuzlar, etilendiamintetraasetik asit kenetleme maddesi, guanidin tuzu (guanidin izotiyosiyanat, guanidin hidroklorür, vb.), anyonik yüzey aktif madde (dodekan) Sodyum sülfat), katyonik yüzey aktif madde (tetradesil trimetil amonyum oksalat), fenol, 8-hidroksikinolin, ditiyotreitol, proteinaz K ve diğer birkaç veya daha fazla bileşendir.Şu anda birçok nükleik asit ekstraksiyon kiti türü vardır ve farklı nükleik asit ekstraksiyon ve saflaştırma reaktifleri kullanılmaktadır.Aynı nükleik asit ekstraksiyon ve saflaştırma reaktifi kullanılsa bile her kitin ekstraksiyon prosedürleri farklıdır.

Şu anda Ulusal Tıbbi Ürünler İdaresi tarafından onaylanan nükleik asit tespit kiti ürünleri, SARS-CoV-2 genomundaki ORF1ab, E ve N genlerine göre seçilmektedir.Farklı ürünlerin saptama ilkeleri temel olarak aynıdır ancak primerleri ve prob tasarımları farklıdır.Tek hedefli segmentler (ORF1ab), çift hedefli segmentler (ORF1ab, N veya E) ve üç hedefli segmentler (ORF1ab, N ve E) vardır.Saptama ve yorumlama, nükleik asit ekstraksiyonu ve gerçek zamanlı floresan RT-PCR reaksiyon sistemi arasındaki fark, ilgili kit talimatlarına bakmalıdır ve kullanıcıların yorumlama için kit talimatlarında belirtilen yorumlama yöntemini kesinlikle takip etmeleri önerilir.Gerçek zamanlı floresan RT-PCR ile çoğaltılan ortak bölgeler, primerler ve prob dizileri P3'te gösterilmektedir.

P3 SARS-CoV-2 amplikon hedefinin genom üzerindeki konumu ve primerler ile probların dizisi

SARS-CoV-2 nükleik asit tayini sonuçlarının yorumlanması (Real-Time floresan RT-PCR)

“SARS-CoV-2 Enfeksiyonu için Pnömoni Önleme ve Kontrol Planı (İkinci Baskı)” ilk kez tek gen amplifikasyonunun sonuçlarını değerlendirmek için kriterleri netleştirdi:

1. Hiçbir Ct veya Ct≥40 negatif değildir;

2. Ct<37 pozitiftir;

3. 37-40 Ct değeri gri tonlamalı alandır.Deneyin tekrarlanması tavsiye edilir.Ct<40'ı tekrarlamanın sonucu ve amplifikasyon eğrisi belirgin tepe noktalarına sahipse, numune pozitif olarak değerlendirilir, aksi halde negatiftir."

Kılavuzun üçüncü baskısı ve kılavuzun dördüncü baskısı yukarıdaki kriterleri sürdürdü.Bununla birlikte, ticari kitlerde kullanılan farklı hedefler nedeniyle, kılavuzun yukarıda belirtilen 3. baskısı, hedef kombinasyonlarının belirlenmesine yönelik kriterleri vermemiş ve üretici tarafından sağlanan talimatların geçerli olacağını vurgulamıştır.Kılavuzların beşinci baskısından başlayarak, özellikle yargılanması zor olan tek bir hedef için yargılama kriterleri olmak üzere iki hedef netleştirilmiştir.Yani, laboratuvar bir vakanın SARS-CoV-2 nükleik asit tespiti için pozitif olduğunu doğrulamak istiyorsa, aşağıdaki 2 koşuldan 1'inin karşılanması gerekir:

(1) Aynı numunedeki iki SARS-CoV-2 hedefi (ORF1ab, N) gerçek zamanlı floresan RT-PCR ile pozitif olarak test edilir.Tek bir hedef pozitifse, yeniden örnekleme ve yeniden test gereklidir.Test sonuçları tek hedef hala pozitif ise, pozitif olarak değerlendirilir.

(2) İki gerçek zamanlı floresan RT-PCR numunesi, aynı anda tek bir hedef pozitif gösterdi veya aynı türden iki numune, pozitif olarak değerlendirilebilecek tek bir hedef pozitif test sonucu gösterdi.Bununla birlikte kılavuzlar, nükleik asit testinin negatif sonuçlarının SARS-CoV-2 enfeksiyonunu dışlayamayacağını da vurgulamaktadır.Kötü numune kalitesi (orofarinks ve diğer parçalardan solunum örnekleri), numunenin çok erken veya çok geç alınması, numunelerin doğru şekilde saklanmaması, taşınmaması ve işlenmemesi ve teknolojinin kendisinde sorunlar olması (virüs varyasyonu, PCR inhibisyonu) vb. gibi yanlış negatiflere neden olabilecek faktörlerin hariç tutulması gerekir.

SARS-CoV-2 tespitinde yanlış negatiflerin nedenleri

Şu anda söz konusu olan nükleik asit testinde "yanlış negatif" kavramı, genellikle nükleik asit testi sonuçlarının klinik belirtilerle tutarsız olduğu, yani klinik semptomların ve görüntüleme sonuçlarının COVID-19'dan yüksek oranda şüphelenildiği, ancak nükleik asit testlerinin birçok kez her zaman "negatif" olduğu "yanlış negatifleri" ifade eder.Ulusal Sağlık Komisyonu'nun Klinik Laboratuvar Merkezi, "yanlış negatif" SARS-CoV-2 testini açıkladı.

(1) Enfekte olan kişinin hücrelerinde belli miktarda virüs bulunur.Mevcut veriler, vücuda virüs bulaştıktan sonra virüsün burun ve ağız yoluyla boğaza girdiğini, ardından trakea ve bronşlara ve ardından alveollere ulaştığını gösteriyor.Enfekte olan kişi kuluçka dönemini, hafif semptomları ve ardından şiddetli semptomların sürecini ve hastalığın farklı aşamalarını yaşayacaktır.Ve vücudun farklı bölgelerinde bulunan virüs miktarı farklıdır.

Hücre tiplerinin viral yükü açısından alveolar epitel hücreleri (alt solunum yolu)> hava yolu epitel hücreleri (üst solunum yolu)> fibroblastlar, endotel hücreleri ve makrofajlar vb.;numune tipinden, alveoler lavaj sıvısı (en Mükemmel)> derin öksürük balgamı> nazofaringeal sürüntü>orofaringeal sürüntü>kan.Ayrıca virüs dışkıda da tespit edilebiliyor.Ancak, operasyonun kolaylığı ve hastaların kabulü göz önünde bulundurulduğunda, yaygın olarak kullanılan klinik numune sırası orofaringeal sürüntü>nazofaringeal sürüntü>bronş lavaj sıvısı (kompleks operasyon) ve derin balgam (genellikle kuru öksürük, elde edilmesi zor) şeklindedir.

Bu nedenle, bazı hastaların orofarinks veya nazofarenks hücrelerindeki virüs miktarı az veya çok düşüktür.Test için sadece orofarenks veya nazofarenks örnekleri alınırsa, viral nükleik asit tespit edilmeyecektir.

(2) Numune toplama sırasında virüs içeren hücre toplanmadı veya viral nükleik asit etkili bir şekilde korunmadı.

[① Uygun olmayan toplama yeri, örneğin orofaringeal swabları toplarken, toplama derinliği yeterli değildir, toplanan nazofaringeal swablar burun boşluğunun derinliklerinde toplanmaz, vb. Toplanan hücrelerin çoğu virüssüz hücreler olabilir;

②Numune alma bezleri yanlış kullanılıyor.Örneğin, temizleme bezi kafasının malzemesi olarak PE lifi, polyester lifi ve polipropilen lifi gibi sentetik lifler önerilir.Gerçek operasyonda pamuk gibi doğal lifler kullanılır (güçlü protein adsorpsiyonu ve yıkanması kolay değildir) Ve naylon lifler (zayıf su emilimi, yetersiz örnekleme hacmine yol açar);

③Nükleik asitleri (DNA/RNA) emmesi kolay olan polipropilen veya polietilen plastik saklama tüplerinin yanlış kullanımı gibi virüs saklama tüplerinin yanlış kullanımı, depolama solüsyonundaki nükleik asit konsantrasyonunda bir azalmaya neden olur.Uygulamada, viral nükleik asitleri depolamak için polietilen-propilen polimer plastik ve bazı özel olarak işlenmiş polipropilen plastik kapların kullanılması tavsiye edilir.]

[① Uygun olmayan toplama yeri, örneğin orofaringeal swabları toplarken, toplama derinliği yeterli değildir, toplanan nazofaringeal swablar burun boşluğunun derinliklerinde toplanmaz, vb. Toplanan hücrelerin çoğu virüssüz hücreler olabilir;

②Numune alma bezleri yanlış kullanılıyor.Örneğin, temizleme bezi kafasının malzemesi olarak PE lifi, polyester lifi ve polipropilen lifi gibi sentetik lifler önerilir.Gerçek operasyonda pamuk gibi doğal lifler kullanılır (güçlü protein adsorpsiyonu ve yıkanması kolay değildir) Ve naylon lifler (zayıf su emilimi, yetersiz örnekleme hacmine yol açar);

③Nükleik asitleri (DNA/RNA) emmesi kolay olan polipropilen veya polietilen plastik saklama tüplerinin yanlış kullanımı gibi virüs saklama tüplerinin yanlış kullanımı, depolama solüsyonundaki nükleik asit konsantrasyonunda bir azalmaya neden olur.Uygulamada, viral nükleik asitleri depolamak için polietilen-propilen polimer plastik ve bazı özel olarak işlenmiş polipropilen plastik kapların kullanılması tavsiye edilir.]

(4) Klinik laboratuvar işlemi standardize edilmemiştir.Numune taşıma ve saklama koşulları, klinik laboratuvarların standardize edilmiş çalışması, sonuçların yorumlanması ve kalite kontrolü, test sonuçlarının doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlayan temel faktörlerdir.Ulusal Sağlık Komisyonu Klinik Laboratuvar Merkezi tarafından 16-24 Mart 2020 tarihlerinde yapılan dış kalite değerlendirme sonuçlarına göre geçerli sonuç alan 844 laboratuvardan 701'i (%83,1) kalifiye olmuş, 143'ü (%16,9) kalifiye olmamıştır.Nitelikli, genel laboratuvar test koşulları iyidir, ancak farklı laboratuvarların personel çalıştırma becerisi, tek hedefli pozitif numune yorumlama yeteneği ve kalite kontrolü konusunda hâlâ farklılıkları vardır.

SARS-CoV-2 nükleik asit tespitinin yanlış negatifliği nasıl azaltılır?

Nükleik asit tespitinde yanlış negatiflerin azaltılması, yanlış negatifler üretmenin dört yönünden optimize edilmelidir.

(1) Enfekte olan kişinin hücrelerinde belli miktarda virüs bulunur.Enfekte olduğundan şüphelenilen kişilerin vücudunun farklı bölgelerindeki virüs konsantrasyonu, farklı zamanlarda farklı olacaktır.Yutak yoksa bronş lavaj sıvısında veya dışkıda olabilir.Test için aynı anda veya hastalık ilerlemesinin farklı aşamalarında birden çok türde numune alınabiliyorsa, yanlış negatif sonuçların önlenmesine yardımcı olur.

(2) Örnek toplama sırasında virüs içeren hücreler toplanmalıdır.Bu sorun, numune toplayıcıların eğitimi güçlendirilerek büyük ölçüde çözülebilir.

(3) Güvenilir IVD reaktifleri.Ulusal düzeyde reaktiflerin tespit performans değerlendirmesi üzerine araştırma yapılarak ve mevcut problemler tartışılarak, reaktiflerin tespit etkinliği daha da geliştirilebilir ve analizin hassasiyeti geliştirilebilir.

(4) Klinik laboratuvarların standardize edilmiş işleyişi.Laboratuvar personelinin eğitimini güçlendirerek, laboratuvar kalite yönetim sistemini sürekli iyileştirerek, makul bölünmeler sağlayarak ve personelin saptama yeteneğini geliştirerek, uygun olmayan laboratuvar işlemlerinden kaynaklanan yanlış negatifleri azaltmak mümkündür.

İyileşen ve taburcu olan hastalarda SARS-CoV-2 nükleik asit testinin tekrar pozitif çıkmasının nedenleri

“COVID-19 Teşhis ve Tedavi Planı (Deneme Yedinci Baskı)”, COVID-19 hastalarının hastaneden iyileşip taburcu olabilmesi için kriterlerden birinin, ardışık iki solunum yolu örneğinin (en az 24 saat arayla) negatif nükleik asit testinin olması olduğunu açıkça belirtmektedir, ancak çok azı vardır. Çeşitli nedenlerle taburcu edilen hastalarda SARS-CoV-2 nükleik asit testi tekrar pozitif çıktı.

(1)SARS-CoV-2 yeni bir virüstür.Patojenik mekanizmasını, neden olduğu hastalığın tam resmini ve hastalık seyrinin özelliklerini daha iyi anlamak gerekir.Bu nedenle bir yandan taburcu olan hastaların yönetimini güçlendirmek ve 14 günlük tıbbi gözlem yapmak gerekiyor.Hastalığın oluşumu, gelişimi ve sonucuna ilişkin tüm sürecin anlaşılmasını derinleştirmek için takip, sağlık izleme ve sağlık rehberliği gerçekleştirin.

(2) Hastaya tekrar virüs bulaşabilir.Akademisyen Zhong Nanshan şunları söyledi: İyileşen hastalarda antikorlar olduğu için, SARS-CoV-2 tekrar istila ettiğinde antikorlar tarafından ortadan kaldırılabilir.Pek çok sebep var, iyileşen hastanın sebebi olabildiği gibi virüsün mutasyonuyla ilgili olabileceği gibi laboratuvar testlerinin de sebebi olabilir.Virüsün kendisi ise SARS-CoV-2 mutasyonu, iyileşen hastanın ürettiği antikorun mutasyona uğramış virüse karşı etkisiz kalmasına neden olabilir.Hastaya tekrar mutasyona uğramış virüs bulaşırsa, nükleik asit testi tekrar pozitif olabilir.

(3) Laboratuvar test yöntemleri söz konusu olduğunda, her test yönteminin sınırlamaları vardır.SARS-CoV-2 nükleik asit tespiti, gen dizisi seçimi, reaktiflerin bileşimi, yöntemin hassasiyeti ve mevcut kitlerin kendi alt tespit limitlerine sahip olmasına yol açan diğer nedenlerden kaynaklanmaktadır.Hasta tedavi edildikten sonra vücuttaki virüs azalır.Test edilecek numunedeki viral yük tespit alt limitinin altına düştüğünde “negatif” bir sonuç çıkacaktır.Ancak bu sonuç vücuttaki virüsün tamamen yok olduğu anlamına gelmez.Virüs, tedavi durdurulduktan sonra olabilir.Diriliş”, kopyalamaya devam edin.Bu nedenle taburcu olduktan sonra 2 ila 4 hafta içinde haftada bir kez gözden geçirilmesi önerilir.

(4) Nükleik asit, virüsün genetik materyalidir.Virüs, hasta antiviral tedavi gördükten sonra öldürülür, ancak kalan viral RNA parçaları hala insan vücudunda tutulur ve vücuttan tamamen atılmaz.Bazen, belirli koşullar altında, daha fazla tutulabilir.Uzun bir süre ve bu sırada nükleik asit testi "geçici" pozitif olacaktır.Hastanın iyileşme süresinin uzaması ile birlikte vücutta kalan RNA fragmanları yavaş yavaş tükendikten sonra nükleik asit testi sonucu negatife dönebilir.

(5) SARS-CoV-2'nin nükleik asit testi sonucu yalnızca viral RNA'nın varlığını veya yokluğunu kanıtlar ve virüsün aktivitesini ve virüsün bulaşıcı olup olmadığını kanıtlayamaz.Tekrar nükleik asit testi pozitif çıkan bir hastanın tekrar enfeksiyon kaynağı olup olmayacağının kanıtlanması gerekir.Klinik örnekler üzerinde virüs kültürü yapmak ve bulaşıcı olduğunu kanıtlamak için “canlı” bir virüs yetiştirmek gerekir.

Özet

Özet olarak, SARS-CoV-2 nükleik asit testi yanlış negatifler, tekrar test pozitifleri ve klinik belirtilerle tutarsız olan diğer durumlardan tamamen kaçınılamaz.Gerçek tarama ve testlerde, gözden kaçan tanı ve yanlış tanıları önlemek amacıyla kapsamlı tanı için klinik semptomlar, görüntüleme incelemeleri (CT) ve laboratuvar testi (nükleik asit testi + virüse özgü antikor testi) sonuçlarının birleştirilmesi önerilir.Test sonuçlarının klinik belirtilerle bariz bir şekilde tutarsız olduğu bulunursa, SARS-CoV-2 virüsü erken enfeksiyonunu, tekrarlayan enfeksiyonu veya diğer solunum yolu virüsü enfeksiyonlarını vb. hariç tutmak için tüm test bağlantısının (numune toplama, dolaşım ve işleme bağlantıları) kapsamlı bir analizinin yapılması önerilir.Koşullar izin verirse, yeniden inceleme için balgam veya alveolar lavaj sıvısı gibi daha hassas numunelerin alınması önerilir.

İlgili ürünler:

SARS-CoV-2 Nükleik Asit Saptama Kiti (Multiplex PCR Floresan Prob Yöntemi)