Primerlerin ve probların performansının PCR reaktiflerinin erken aşamasında doğrulanması ve en uygun reaksiyon koşullarının belirlenmesi, resmi deneylerin sorunsuz ilerlemesini sağlamak için ön koşullardır.
O halde primer probu erken aşamada nasıl doğrulamamız gerekiyor?
Ana göstergeler taban çizgisi, amplifikasyon eğrisi, ct değeri, amplifikasyon verimliliği, düşük konsantrasyonlu numune tespiti, CV, vs.'dir.
temel
Taban çizgisi, PCR amplifikasyon eğrisindeki yatay çizgidir.PCR amplifikasyon reaksiyonunun ilk birkaç döngüsünde, floresan sinyali fazla değişmez ve düz bir çizgi oluşturur.Bu düz çizgi taban çizgisidir.
PCR primer problarını tararken taban çizgisinin düz olup olmadığına dikkat edin.Primer prob konsantrasyonunun saflığı, örneğin taban çizgisinin yükselmesine veya düşmesine neden olmak gibi, taban çizgisini etkileyecektir.Taban çizgisi aynı zamanda çok sezgisel bir göstergedir.
Amplifikasyon Eğrisi
Başka bir sezgisel gösterge, amplifikasyon eğrisinin şeklidir.Sekonder amplifikasyondan veya diğer anormal amplifikasyon eğrilerinden kaçınmak için S şeklinde bir eğriye sahip olmak en iyisidir.
Ct Değeri
Taban çizgisinden üstel büyümeye bükülme noktasına karşılık gelen döngü sayısı Ct değeridir.
Aynı numune için, farklı primer problar farklı amplifikasyon eğrileri ile sonuçlanır ve karşılık gelen Ct değeri, amplifikasyon verimliliğinden ve girişim derecesinden etkilenecektir.Teorik olarak, seçtiğimiz primer probun Ct değeri ne kadar küçükse o kadar iyidir.
Amplifikasyon Verimliliği
PCR amplifikasyon etkinliğini değerlendirmek için en güvenilir ve kararlı yöntemlerden biri, araştırmacılar tarafından da geniş çapta tanınan standart eğridir.Yöntem, hedef şablonların göreli sayısını kontrol etmek için bir dizi numune yapmayı içerir.Bu numuneler genellikle konsantre stok çözeltilerin seri dilüsyonları ile yapılır, en yaygın kullanılanı 10 kat seyreltmedir.Bir dizi seyreltilmiş numune kullanarak, standart qPCR programını kullanarak Cq değerini elde etmek için amplifiye edin ve son olarak Cq= -klgX0+b doğrusal denklemini ve E=10(-1 /k)-1 amplifikasyon verimini elde etmek için her numunenin konsantrasyonuna ve karşılık gelen Cq değerine göre bir standart eğri çizin.Kantitatif analiz için qPCR kullanırken, amplifikasyon verimliliğinin %90-%110 (3.6>k>3.1) aralığında olması gerekir.
Düşük Konsantrasyonlu Numune Tespiti
Numune konsantrasyonu düşük olduğunda, farklı primer probların tespit oranları farklıdır.Çoğaltmak için 20 düşük konsantrasyonlu numune seçiyoruz ve en yüksek tespit oranına sahip primer-prob sistemi en iyisidir.
Varyasyon Katsayısı (CV)
Nükleik asit amplifikasyon tespiti için reaktifin hat standardına göre farklı primer probları ile 10 kopya numune tespit edilebilir.
Kantitatif Reaktifler:
Kesinlik
Bir parti içindeki doğruluk şu şartları sağlamalıdır: test konsantrasyonunun logaritmik değerinin varyasyon katsayısı (CV,%) ≤ %5'tir.Numune konsantrasyonu düşük olduğunda, saptama konsantrasyonunun logaritmasının varyasyon katsayısı (CV,%) ≤ %10'dur
Kalitatif reaktifler:
Kesinlik
Bir parti içindeki doğruluk aşağıdakileri karşılamalıdır:
(1) Ct değerinin değişim katsayısı (CV,%) ≤5%
Aynı numune 10 kez paralel olarak test edilir ve test sonuçları tutarlı olmalıdır
Gönderim zamanı: 18 Eylül-2021
