• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

Herkesin PCR reaksiyonları yaparken her zaman böyle veya böyle sorunlarla karşılaşacağına inanıyorum, ancak bunların çoğunu iki ana sorun olarak sınıflandırabiliriz:

Gen şablonunun çok az amplifikasyonu (amplifikasyon);
Çok fazla hedef olmayan gen amplifikasyonu.
Katkı maddeleri kullanmak, bu sorunları çözmek için yaygın stratejilerden biridir.Genellikle katkı maddelerinin rolünün iki yönü vardır:
ikincil yapıgenlerin (ikincil yapı);
Spesifik olmayan astarlamayı azaltın.
Bugün editör size kısaca PCR reaksiyonlarındaki yaygın katkı maddelerini ve bunların fonksiyonlarını tanıtacak.
İkincil yapıyı azaltan katkılar
sülfoksit(DMSO)
gen örnekleriyüksek GC içeriği ile.Bununla birlikte DMSO, Taq polimeraz aktivitesini de büyük ölçüde azaltır.Bu nedenle, herkesin şablon erişilebilirliği ile polimerazın aktivitesini dengelemesi gerekir.Düzenleyici, denemenize uygun konsantrasyonu bulmak için %2 ila %10 gibi farklı DSMO konsantrasyonlarını deneyebileceğinizi önerir.
iyonik olmayan deterjanlar
%0,1-1 Triton X-100, Tween 20 veya NP-40 gibi iyonik olmayan deterjanlar genellikle DNA ikincil yapısını azaltır.Bu, şablon genin amplifikasyonunu artırabilse de, spesifik olmayan amplifikasyon sorununa da neden olacaktır.Bu nedenle, bu katkı maddeleri, döküntü içermeyen düşük verimli PCR reaksiyonları için iyi çalışır, ancak nispeten saf olmayan PRC reaksiyonları için o kadar iyi çalışmaz.Non-iyonik deterjanların diğer bir faydası da SDS kontaminasyonunun azalmasıdır.Genellikle DNA ekstraksiyon işlemi sırasında, polimerazın aktivitesini büyük ölçüde engelleyen SDS, PCR aşamasına getirilir.Bu nedenle, reaksiyona %0,5 Tween-20 veya Tween-40 eklenmesi, SDS'nin olumsuz etkilerini nötralize edebilir.
betain_
Betain, ikincil yapı oluşumunu azaltarak DNA amplifikasyonunu iyileştirebilir ve genellikle ticari PCR kitlerine "gizemli" bir katkıdır.Betain kullanmak istiyorsanız, betain veya betain mono-hidrat (Betain veya Betaine mono-hidrat) koymalısınız, ancak betain hidroklorür (Betain HCI) koymamalısınız, nihai konsantrasyonu 1-1.7M olacak şekilde ayarlayın.Betain, DNA erimesi/DNA denatürasyonunun baz çifti bileşimi bağımlılığını ortadan kaldırdığı için özgüllüğün geliştirilmesine de yardımcı olabilir.
Spesifik olmayan astarlamayı azaltan katkı maddeleri
formamid
Formamid yaygın olarak kullanılan bir organik PCR katkı maddesidir.DNA'daki ana oluk ve küçük oluk ile birleşebilir, böylece ana DNA çift sarmalının stabilitesini azaltır ve DNA'nın erime sıcaklığını düşürür.PCR deneylerinde kullanılan formamid konsantrasyonu genellikle %1-5'tir.
tetrametilAmonyum Klorür( TMAC)
Tetrametilamonyum klorür, hibridizasyonun özgüllüğünü (hibridizasyon özgüllüğü) artırabilir ve DNA'nın erime sıcaklığını artırabilir.Böylece TMAC, spesifik olmayan hazırlamayı kaldırabilir ve DNA ve RNA'nın yanlış bağlanmasını azaltabilir.Eğer kullanırsandejenere primerlerPCR reaksiyonunda, yaygın olarak 15-100 mM'lik bir konsantrasyonda kullanılan TMAC'ı eklemeyi unutmayın.
Diğer Yaygın Katkı Maddeleri
Yukarıda belirtilen iki katkı maddesi kategorisine ek olarak, PCR reaksiyonlarında birçok ortak katkı maddesi vardır, farklı işlevlere sahip olmalarına rağmen, bunlar da çok önemlidir.
magnezyum iyonu
Magnezyum iyonu, polimerazın vazgeçilmez bir kofaktörüdür (kofaktörüdür), yani magnezyum iyonu olmadan polimeraz inaktiftir.Bununla birlikte, çok fazla magnezyum iyonu da polimerazın etkinliğini etkileyebilir.Her PCR reaksiyonundaki magnezyum iyonlarının konsantrasyonu değişecektir.Şelatlayıcı ajanlar (EDTA veya sitrat gibi), dNTP'lerin ve proteinlerin konsantrasyonu, magnezyum iyonlarının konsantrasyonunu etkiler.Bu nedenle, PCR deneyinizle ilgili sorunlarınız varsa, farklı magnezyum iyonu konsantrasyonlarını, örneğin 1,0'dan 4,0 mM'ye, aralarında 0,5–1 mM'lik bir aralık bırakarak değiştirmeyi deneyebilirsiniz.
Birden fazla donma-çözülme döngüsünün, magnezyum klorür çözeltisinin konsantrasyon katmanlaşmasına yol açabileceğini belirtmekte fayda var.Bu nedenle her kullanımdan önce tamamen eritmeli ve kullanmadan önce iyice karıştırmalısınız.
Sığır serum albumini(Sığır albümini, BSA)
Moleküler kimya deneylerinde sığır serum albümini, özellikle restriksiyon enzimi sindirimi ve PCR deneylerinde çok yaygın bir katkı maddesidir.PCR reaksiyonlarında BSA, fenolik bileşikler gibi kontaminantları azaltmada yardımcı olur.Ayrıca reaktanların test tüpünün duvarına yapışmasını azaltabileceği de söylenmektedir.PCR reaksiyonunda genellikle eklenen BSA konsantrasyonu 0,8 mg/ml'ye ulaşabilir.
 
İlgili ürünler:
PCR Kahramanı(boya ile)
PCR Kahramanı


Gönderim zamanı: 10 Şubat 2023