• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

Direkt PCR, nükleik asit ekstraksiyonu olmadan amplifikasyon için doğrudan hayvan veya bitki dokularını kullanan bir reaksiyondur.Birçok yönden doğrudan PCR, normal PCR gibi çalışır.

Ana fark, doğrudan PCR'de kullanılan özel tampondur, numune, nükleik asit ekstraksiyonu olmadan doğrudan PCR reaksiyonuna tabi tutulabilir, ancak enzimlerin toleransı ve doğrudan PCR reaksiyonunda yer alan tamponun uyumluluğu için karşılık gelen gereksinimler vardır.

Yaygın örneklerde az ya da çok PCR inhibitörü olmasına rağmen, doğrudan PCR enzimlerin ve tamponların etkisi altında güvenilir amplifikasyon sağlayabilir.Geleneksel PCR reaksiyonu, şablon olarak yüksek kaliteli nükleik asit gerektirir; bu, şablon proteinler ve diğer safsızlıklar içeriyorsa PCR reaksiyonunun düzgün ilerlemesini engelleyebilmektedir.Direkt PCR, şu anda moleküler teşhis alanında en popüler teknolojilerden biridir.

01 Doğrudan PCR başlangıçta hayvan ve bitki için kullanıldı

Direkt PCR'nin en eski uygulaması, genotipleme, transgenik, plazmid tespiti, Gen nakavt analizi, DNA kaynağı tanımlama, tür tanımlama, SNP analizi ve diğer alanları incelemek için kullanılan sıçan kanı, dokusu ve tüyü, kedi, tavuk, tavşan, koyun, sığır vb., bitki yaprakları ve tohumları vb. gibi hayvanlar ve bitkiler alanındadır.

Bu alanların bazı ortak özellikleri vardır, yani hedef gen içeriği nispeten yüksektir ve nükleik asit ekstraksiyonu zahmetlidir, bu nedenle doğrudan PCR yalnızca zamandan tasarruf sağlamakla kalmaz ve sonuçlar üzerinde küçük bir etkiye sahip olabilir, aynı zamanda maliyetten de tasarruf sağlar.

Patojen tespiti için kullanılan direkt PCR son yıllarda gündeme gelmiştir, bazı PCR reaktif üreticileri yenilik yaparken bu yönde çok çaba sarf etmişlerdir.Özellikle bu COVID-19 salgınında, insan nazofaringeal veya orofaringeal sürüntü örneklerinde SARS-CoV-2 nükleik asitlerin kalitatif tespiti için Real-time RT PCR teknolojisini (rRT-PCR) kullanan Foregene tarafından araştırılıp geliştirilen SARS-CoV-2 Nükleik Asit Tespit Kiti (Multiplex PCR Floresan Prob Metodu) gibi bu tür birçok tespit ürünü piyasada göründü.

Foregene, normal ORF1ab, N, E vedeğişken SARS-CoV-2 B.1.1.7 soyu (UK), B.1.351 soyu (ZA), B.1.617 soyu (IND) ve P.1 soyu (BR) gibi insan nazofaringeal veya orofarengeal sürüntü numunelerindeki nükleik asit soyları.

02  Doğrudan PCR için gerekli reaktifler

Örnek Lizat

Örnek lizat kendiniz yapılandırılabilir veya satın alınabilir.Farklı lizat markalarının bileşimindeki fark, parçalama yeteneğini farklı kılacak ve ardından parçalama süresi biraz farklı olacaktır.Örneğin, hayvan doku numunelerinin hazırlanması için genellikle 30 dakika veya gece boyunca lizis önerilir ve virüsler için lizis solüsyonu 3-10 dakika arasında değişir.

PCR ana karışımı

Spesifik amplifikasyonu geliştirmek ve amplifikasyon yeteneğini artırmak için sıcak başlangıçlı DNA polimerazın kullanılması önerilir.Direkt PCR'nin özü, oldukça toleranslı bir polimerazdır.

Numunedeki DNA amplifikasyonunu etkileyen bileşenleri ortadan kaldırın veya inhibe edin

Numune lizatla işlendikten sonra proteinler, lipitler ve diğer hücre kalıntıları salınacak, bu maddeler PCR reaksiyonunu engelleyecektir.Bu nedenle, doğrudan PCR, bu faktörlerin etkisini azaltmak için karşılık gelen çıkarma veya inhibitörlerin eklenmesini gerektirir.

03  Doğrudan PCR'nin beş bilgi noktasından oluşan bir koleksiyon

Birincisi, Direct PCR teknolojisi, çeşitli biyolojik numuneler için doğrudan bir PCR teknolojisidir.Bu teknik koşul altında, nükleik asidi ayırmaya ve ekstrakte etmeye, doğrudan doku örneğini nesne olarak kullanmaya ve PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için hedef gen primerlerini eklemeye gerek yoktur.

İkincisi, Doğrudan PCR teknolojisi yalnızca geleneksel bir DNA şablonu amplifikasyon teknolojisi değildir, aynı zamanda RNA şablonu ters transkripsiyon PCR'yi de içerir.

Üçüncüsü, Doğrudan PCR teknolojisi yalnızca doku numuneleri üzerinde rutin kalitatif PCR reaksiyonlarını doğrudan gerçekleştirmekle kalmaz, aynı zamanda reaksiyon sisteminin güçlü anti-arka plan flüoresan girişim kabiliyetine sahip olmasını ve endojen flüoresansın antagonistik yeteneği söndürmesini gerektiren Gerçek Zamanlı qPCR reaksiyonlarını da içerir.

Dördüncüsü, Direct PCR teknolojisi tarafından hedeflenen numuneler yalnızca nükleik asit şablonlarının salınmasına ihtiyaç duyar ve PCR reaksiyonuna müdahale eden proteinleri, polisakkaritleri, tuz iyonlarını vb. çıkarmaz.Bu da reaksiyon sistemindeki nükleik asit polimeraz ve PCR Karışımının karmaşık koşullar altında enzim aktivitesi ve replikasyon doğruluğunu sağlamak için mükemmel dirence ve uyarlanabilirliğe sahip olmasını gerektirir.

Beşincisi, herhangi bir nükleik asit zenginleştirme işlemi olmadan Doğrudan PCR teknolojisi tarafından hedeflenen doku örneği ve şablon miktarı çok küçüktür, bu da reaksiyon sisteminin son derece yüksek hassasiyete ve amplifikasyon verimliliğine sahip olmasını gerektirir.


Gönderim zamanı: 28 Haziran 2021