Floresan kantitatif PCR (TaqMan PCR olarak da bilinir, bundan sonra FQ-PCR olarak anılacaktır), 1995 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde PE (Perkin Elmer) tarafından geliştirilen yeni bir nükleik asit kantitatif teknolojisidir. Bu teknoloji, floresan etiketli problar ekleyerek geleneksel PCR'ye dayanmaktadır.Esnek PCR ile karşılaştırıldığında, FQ-PCR'nin kantitatif işlevini gerçekleştirmek için birçok avantajı vardır.Bu makale, teknolojinin özelliklerini, ilkelerini, yöntemlerini ve uygulamalarını kısaca açıklamayı amaçlamaktadır.
1 Özellikler
FQ-PCR sadece sıradan PCR'nin yüksek hassasiyetine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda flüoresan probların uygulanması nedeniyle, geleneksel PCR'nin birçok eksikliğinin üstesinden gelen kantitatif sonuçlar elde etmek için fotoelektrik iletim sistemi aracılığıyla PCR amplifikasyonu sırasında flüoresan sinyalinin değişimini doğrudan tespit edebilir, bu nedenle aynı zamanda DNA hibridizasyonunun yüksek özgüllüğüne ve spektroskopi teknolojisinin yüksek doğruluğuna sahiptir.
Örneğin, genel PCR ürünlerinin ultraviyole ışıkla agaroz jel elektroforezi ve etidyum bromür boyaması veya poliakrilamid jel elektroforezi ve gümüş boyaması ile gözlemlenmesi gerekir.Bu sadece birden fazla araç gerektirmez, aynı zamanda zaman ve çaba gerektirir.Ethidium bromide kullanılan lekeler insan vücuduna zararlıdır ve bu karmaşık deneysel prosedürler, kirlilik ve yanlış pozitifler için fırsatlar sağlar.Bununla birlikte, FQ-PCR'nin numune yükleme sırasında kapağı yalnızca bir kez açması gerekir ve sonraki işlem tamamen kapalı tüp işlemidir; bu, PCR son işlemesini gerektirmez ve geleneksel PCR operasyonlarındaki birçok dezavantajı ortadan kaldırır.Deney genellikle PE şirketi tarafından geliştirilen ABI7100 PCR termal döngüleyiciyi kullanır.
Alet aşağıdaki özelliklere sahiptir: ① Geniş uygulama: DNA ve RNA PCR ürün kantifikasyonu, gen ekspresyon araştırması, patojen tespiti ve PCR koşullarının optimizasyonu için kullanılabilir.② Eşsiz kantitatif prensip: Floresan etiketli problar kullanıldığında, ölçüm amacına ulaşmak için lazer uyarımından sonra PCR döngüsü ile floresans miktarı birikecektir.③ Yüksek çalışma verimliliği: Dahili 9600 PCR termal döngüleyici, 96 numunenin amplifikasyonunu ve kantifikasyonunu otomatik ve eşzamanlı olarak tamamlamak için bilgisayar kontrollü 1 ila 2 saat.④ Jel elektroforezine gerek yok: Numuneyi seyreltmeye ve elektroforeze gerek yok, doğrudan reaksiyon tüpünde tespit etmek için özel bir prob kullanın.⑤Boru hattında kirlilik yok: Eşsiz tamamen kapalı reaksiyon tüpü ve fotoelektrik iletim sistemi benimsenmiştir, bu nedenle kirlilik konusunda endişelenmenize gerek yoktur.⑥Sonuçlar tekrarlanabilir: kantitatif dinamik aralık beş büyüklük mertebesine kadardır.Bu nedenle, bu teknoloji başarıyla geliştirildiğinden beri birçok bilimsel araştırmacı tarafından değer görmüş ve birçok alanda uygulanmıştır.
2 İlkeler ve yöntemler
FQ-PCR'nin çalışma prensibi, PCR reaksiyon sistemine floresan etiketli bir prob eklemek için Taq enziminin 5'→3' ekzonükleaz aktivitesini kullanmaktır.Prob, primer sekansında bulunan DNA şablonu ile spesifik olarak hibritlenebilir.Probun 5' ucu, floresans emisyon geni FAM (6-karboksifloresein, 518nm'de floresans emisyon tepe noktası) ile etiketlenir ve 3'ucu, floresans söndürme grubu TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin, 582nm'de floresan emisyon tepe noktası) ile etiketlenir, probun 3'başı, PCR amplifikasyonu sırasında probun uzamasını önlemek için fosforile edilir.Prob bozulmadan kaldığında söndürücü grup, yayan grubun floresan emisyonunu bastırır.Yayıcı grup söndürme grubundan ayrıldıktan sonra inhibisyon kaldırılır ve 518nm'deki optik yoğunluk artar ve floresan saptama sistemi tarafından tespit edilir. Renatürasyon fazında, prob şablon DNA ile hibritlenir ve uzatma fazındaki Taq enzimi, primerin uzaması ile DNA şablonu boyunca hareket eder.Prob kesildiğinde, söndürme etkisi serbest bırakılır ve floresan sinyali serbest bırakılır.Şablon her kopyalandığında, bir flüoresan sinyalinin serbest bırakılmasıyla birlikte bir prob kesilir.Serbest bırakılan floroforların sayısı ile PCR ürünlerinin sayısı arasında bire bir ilişki olduğundan, bu teknik, şablonu doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.Deney aleti genellikle PE şirketi tarafından geliştirilen ABI7100 PCR termal döngüleyiciyi kullanır ve diğer termal döngüleyiciler de kullanılabilir.Deney için ABI7700 reaksiyon tipi reaksiyon sistemi kullanılırsa, reaksiyon tamamlandıktan sonra bilgisayar analizi yoluyla kantitatif sonuçlar doğrudan verilebilir.Diğer termal döngüleyicileri kullanıyorsanız, RQ+, RQ-, △RQ'yu hesaplamak için aynı anda reaksiyon tüpündeki floresan sinyalini ölçmek üzere bir floresan detektörü kullanmanız gerekir.RQ+, numune tüpünün flüoresan emisyon grubunun lüminesans yoğunluğunun söndürme grubunun lüminesans yoğunluğuna oranını temsil eder, RQ- boş tüpteki ikisinin oranını temsil eder, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) PCR sırasında flüoresan sinyal değişikliği miktarını temsil eder Veri işlemeden sonra nicel sonuçlar elde edilebilir.Floresan probların tanıtılması nedeniyle, deneyin özgüllüğü önemli ölçüde iyileştirildi.Prob tasarımı genel olarak aşağıdaki koşulları karşılamalıdır: ①Bağlanma özgüllüğünü sağlamak için probun uzunluğu yaklaşık 20-40 baz olmalıdır.②Tek nükleotit sekanslarının tekrarlanmasını önlemek için GC bazlarının içeriği %40 ila %60 arasındadır.③ Hibridizasyondan veya primerlerle örtüşmekten kaçının.④ Prob ve şablon arasındaki bağlanmanın stabilitesi, primer ve şablon arasındaki bağlanmanın stabilitesinden daha fazladır, bu nedenle probun Tm değeri, primerin Tm değerinden en az 5°C daha yüksek olmalıdır.Ek olarak, probun konsantrasyonu, prob ile şablon dizisi arasındaki homoloji ve prob ile primer arasındaki mesafenin hepsinin deneysel sonuçlar üzerinde etkisi vardır.
İlgili ürünler:
Çin Gerçek Zamanlı PCR Easyᵀᴹ-Taqman Üretici ve Tedarikçi |Foregene (foreivd.com)
Gönderim zamanı: Ekim-15-2021
