qPCR deneylerinde primer tasarımı da çok önemli bir bağlantıdır.Primerlerin uygun olup olmadığı, amplifikasyon veriminin standarda ulaşıp ulaşmadığı, amplifiye edilen ürünlerin spesifik olup olmadığı ve deneysel sonuçların mevcut olup olmadığı ile yakından ilgilidir.
Peki qPCR primer özgüllüğü nasıl daha iyi hale getirilir?Yüksek amplifikasyon verimliliği?
Bugün sizi birlikte qPCR primerleri tasarlamaya götüreceğiz ve qPCR primer tasarımının deneylerde etkili bir irfan becerisi olmasına izin vereceğiz.
qPCR primerlerini tasarlarken genellikle şu noktalara dikkat edin: primerler mümkün olduğunca intronlar arasında tasarlanmalı, ürün uzunluğu 100-300 bp olmalı, Tm değeri mümkün olduğunca 60°C'ye yakın olmalı ve yukarı ve aşağı primerler mümkün olduğunca yakın olmalı ve primerin sonu G veya C vb.
1. İntronları kapsayan primerlerin tasarımı
qPCR primerleri tasarlanırken, intronlar boyunca tasarlanmış primerlerin seçilmesi gDNA şablonunun amplifikasyonunu önleyebilir ve ürünlerin tamamı cDNA amplifikasyonundan türetilir, böylece gDNA kontaminasyonunun etkisi ortadan kalkar.
2. Astar uzunluğu
Primer uzunluğu genellikle 18-30 nt arasındadır ve amplifikasyon ürününün uzunluğu mümkün olduğunca 100-300 bp arasında kontrol edilmelidir.
Primer çok kısa olursa non-spesifik amplifikasyona yol açar, çok uzun olursa sekonder yapıyı (saç tokası yapısı gibi) kolayca oluşturur.Amplifikasyon ürünü çok uzunsa, PCR amplifikasyonunun etkinliğini etkileyecek olan polimeraz reaksiyonu için uygun değildir.
3. GC içeriği ve Tm değeri
Primerlerin GC içeriği %40 ile %60 arasında kontrol edilmelidir.Çok yüksek veya çok düşük ise, reaksiyonu başlatmak için elverişli değildir.Aynı Tm değerini ve tavlama sıcaklığını elde etmek için ileri ve geri primerlerin GC içeriğinin aynı olması gerekir.
Tm değeri mümkün olduğunca 55-65°C arasında, genellikle 60°C civarında olmalı ve yukarı ve aşağı akış Tm değeri mümkün olduğunca yakın, tercihen 4°C'den fazla olmamalıdır.
4. Astarın 3' ucunda A seçmekten kaçının
Primerin 3' ucu uyumsuz olduğunda, farklı bazların sentez verimliliğinde büyük farklılıklar vardır.Son baz A olduğunda, uyumsuzluk durumunda bile zincir sentezini başlatabilir ve son baz T olduğunda, uyumsuzluk indüksiyonunun etkinliği büyük ölçüde azalır.Bu nedenle, astarın 3' ucunda A'yı seçmekten kaçının ve T'yi seçmek daha iyidir.
Bu bir prob primeriyse, probun 5' ucu G olamaz çünkü FAM floresan raportör grubuna tek bir G bazı bağlandığında bile G, FAM grubu tarafından yayılan floresan sinyali söndürerek yanlış negatif sonuçlara neden olabilir.Belli olmak.
5. Temel dağıtım
Primerdeki dört bazın dağılımı tercihen rasgele olup, 3' ucunda 3 ardışık G veya C'den ve ardışık 3'ten fazla kaçınılır.G veya C'nin, GC açısından zengin sekans bölgesinde eşleştirme oluşturması kolaydır.
6. Astar tasarım bölgesi, karmaşık ikincil yapılardan kaçınmalıdır.
Amplifikasyon ürününün tek ipliği tarafından oluşturulan ikincil yapı, PCR'nin düzgün ilerlemesini etkileyecektir.Hedef sekansta ikincil bir yapı olup olmadığını önceden tahmin ederek, primerlerin tasarımında bu bölgeden kaçınmaya çalışın.
7. Primerlerin kendileri ve primerler arasında ardışık tamamlayıcı bazlardan kaçınmaya çalışılmalıdır.
Primer ile primer arasında ardışık 4 baz tamamlayıcılık olamaz.Astarın kendisi tamamlayıcı bir sekansa sahip olmamalıdır, aksi takdirde, primer ve şablonun tavlama kombinasyonunu etkileyecek olan bir saç tokası yapısı oluşturmak için kendini katlayacaktır.
Yukarı akış ve aşağı akış primerleri arasında tamamlayıcı diziler bulunamaz.Primerler arasındaki tamamlayıcılık, PCR etkinliğini azaltacak ve hatta kantitatif doğruluğu etkileyecek olan primer dimerleri üretecektir.Primer-dimer ve saç tokası yapıları kaçınılmaz ise △G değeri çok yüksek olmamalıdır (4,5 kcal/mol'den az olmalıdır).
8. Primerler hedefe özel ürünü güçlendirir.
qPCR tespitinin nihai amacı, hedef genin bolluğunu anlamaktır.Spesifik olmayan amplifikasyon oluşursa, niceleme hatalı olacaktır.Bu nedenle primerler tasarlandıktan sonra BLAST tarafından test edilmeleri gerekir ve ürünlerin özgüllükleri dizi veri tabanında karşılaştırılır.
Daha sonra, qPCR primerlerini tasarlamak için insan GAS6 (Growth arrest spesifik 6) genini örnek olarak alıyoruz.
01 sorgu geni
Homo GAZ6NCBI aracılığıyla.Burada gen adı ve türü karşılaştırmaya dikkat ederek tutarlı olmalarını sağlamalıyız.
02 Gen dizisini bulun
(1) Hedef dizi genomik DNA ise, genin genomik DNA dizisi olan ilkini seçin.
(2) Hedef dizi mRNA ise, ikinciyi seçin.Girdikten sonra, aşağıdaki tabloda “CDS” seçeneğini tıklayın.Kahverengi arka plan dizisi, genin kodlama dizisidir.
03 Tasarım astarları
Primer-BLAST arayüzüne girin
Sol üst kısma gen dizi numarasını veya Fasta formatındaki diziyi girin ve ilgili parametreleri doldurun.

"Primerleri al"a tıklayın ve NCBI size bu tür parametre seçiminin diğer birleştirme varyantlarına yükseltileceğini söylemek için açılır.Farklı birleştirme varyantlarını kontrol edebilir ve uygun primer çiftini elde etmek için gönderebiliriz (aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi).Bu işlemin çalışması onlarca saniye sürebilir.
Bu primer çiftlerinin tavlama sıcaklıkları 60°C civarındadır.Deneyin amacına göre, deney için primerlerin orta uzunlukta, iyi özgüllüğe ve daha az kendi kendini tamamlamasına sahip primerleri seçin ve başarı oranı oldukça yüksektir!
04Primer özgüllük doğrulaması
Aslında Primer-Blast, astar tasarlamanın yanı sıra kendi tasarladığımız astarları da değerlendirebilir.Primer tasarım sayfasına dönün, tasarladığımız yukarı ve aşağı primerleri girin, diğer parametreler ayarlanmayacaktır.Gönderdikten sonra, primer çiftinin diğer genlerde de var olup olmadığını görebilirsiniz.Bunların hepsi çoğaltmak istediğimiz gen üzerinde görüntüleniyorsa, bu, bu primer çiftinin özgüllüğünün harika olduğunu gösterir!(Örneğin, birincil sorgunun tek sonucu budur!)

05 Primer kalite değerlendirmesi
"Standartlara kadar amplifikasyon verimliliği", "amplifiye ürün özellikleri" ve "güvenilir deneysel sonuçlar"ı bir araya getiren "mükemmel" primer ne tür bir primerdir?
Amplifikasyon verimliliği

erime eğrisi
Primerlerin amplifikasyon verimliliği %90-%110'a ulaşır, bu amplifikasyon verimliliğinin iyi olduğu ve erime eğrisinin tek bir zirveye sahip olduğu ve genellikle Tm>80°C olduğu anlamına gelir, bu da amplifikasyon özgüllüğünün iyi olduğu anlamına gelir.
 
İlgili ürünler:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Gerçek Zamanlı PCR Easy-Taqman