Moleküler teşhis teknolojisi, hastalıkları tahmin etme ve teşhis etme amacına ulaşmak için insan vücudunun genetik materyalinin ve çeşitli patojenlerin ekspresyonunu ve yapısını tespit etmek için moleküler biyoloji yöntemlerini kullanır.

Son yıllarda, moleküler teşhis teknolojisinin güncellenmesi ve yinelenmesiyle, moleküler teşhisin klinik uygulaması giderek daha kapsamlı ve derinlemesine hale geldi ve moleküler teşhis pazarı hızlı bir gelişme dönemine girdi.

Yazar, piyasadaki yaygın moleküler teşhis teknolojilerini özetlemektedir ve üç kısma ayrılmıştır: ilk kısım PCR teknolojisini, ikinci kısım nükleik asit izotermal amplifikasyon teknolojisini ve ikinci kısım dizileme teknolojisini tanıtmaktadır.

01

Bölüm I: PCR Teknolojisi

PCR teknolojisi

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), 30 yılı aşkın bir geçmişi olan in vitro DNA amplifikasyon teknolojilerinden biridir.

PCR teknolojisinin öncülüğünü 1983 yılında Cetus, ABD'den Kary Mullis yaptı.Mullis, 1985 yılında bir PCR patenti için başvurdu ve aynı yıl Science üzerine ilk PCR akademik makalesini yayınladı.Mullis, 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü'nü kazandı.

PCR'nin Temel Prensipleri

PCR, hedef DNA fragmanlarını bir milyondan fazla çoğaltabilir.Prensip, DNA polimerazın katalizi altında, ana sarmal DNA'nın bir şablon olarak kullanılması ve uzama için başlangıç ​​noktası olarak spesifik bir primerin kullanılmasıdır.Denatürasyon, tavlama ve uzatma gibi adımlarla in vitro çoğaltılır.Ana iplikçik şablon DNA'sını tamamlayıcı olan kız iplikçik DNA'sının süreci.

Standart PCR işlemi üç adıma ayrılır:

1. Denatürasyon: DNA çift sarmallarını ayırmak için yüksek sıcaklık kullanın.DNA çift sarmalları arasındaki hidrojen bağları yüksek sıcaklıklarda (93-98°C) kırılır.

2. Tavlama: Çift sarmallı DNA ayrıldıktan sonra primerin tek sarmallı DNA'ya bağlanabilmesi için sıcaklık düşürülür.

3. Uzatma: DNA polimeraz, sıcaklık düşürüldüğünde bağlanan primerlerden DNA şeritleri boyunca tamamlayıcı şeritleri sentezlemeye başlar.Uzatma tamamlandığında, bir döngü tamamlanır ve DNA fragmanlarının sayısı iki katına çıkar.

Bu üç adımı 25-35 kez tekrarlayarak, DNA fragmanlarının sayısı katlanarak artacaktır.

PCR'nin yaratıcılığı, farklı hedef genler için farklı primerlerin tasarlanabilmesi ve böylece hedef gen fragmanlarının kısa sürede amplifiye edilebilmesidir.

Şimdiye kadar PCR, sıradan PCR, floresan kantitatif PCR ve dijital PCR olmak üzere üç kategoriye ayrılabilir.

Sıradan PCR'nin ilk nesli

Hedef geni amplifiye etmek için sıradan bir PCR amplifikasyon aleti kullanın ve ardından ürünü saptamak için agaroz jel elektroforezi kullanın, yalnızca kalitatif analiz yapılabilir.

Birinci nesil PCR'nin ana dezavantajları:

-Spesifik olmayan amplifikasyona ve yanlış pozitif sonuçlara eğilimlidir.

- Tespiti uzun zaman alır ve operasyon külfetlidir.

-Sadece kalitatif test yapılabilir.

İkinci nesil floresan kantitatif PCR

QPCR olarak da bilinen floresan kantitatif PCR (Real-Time PCR), reaksiyon sisteminin ilerleyişini gösterebilen floresan probları ekleyerek floresan sinyallerin birikmesi yoluyla amplifiye edilmiş ürünlerin birikimini izlemek ve sonuçları floresans eğrisi aracılığıyla yargılamak için kullanılır ve Cq değeri ve standart eğri yardımıyla nicelendirilebilir.

qPCR teknolojisi kapalı bir sistemde yürütüldüğü için kontaminasyon olasılığı azalır ve kantitatif tespit için floresan sinyali izlenebilir, bu nedenle klinik uygulamada en yaygın kullanılan ve PCR'de baskın teknoloji haline gelmiştir.

Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR'de kullanılan floresan maddeler şu şekilde ayrılabilir: TaqMan floresan probları, moleküler işaretçiler ve floresan boyalar.

1) TaqMan floresan probu:

PCR amplifikasyonu sırasında, bir çift primer eklenirken spesifik bir floresan probu eklenir.Prob bir oligonükleotiddir ve iki uç sırasıyla bir raportör floresan grubu ve bir söndürücü floresan grubu ile etiketlenmiştir.

Prob sağlam olduğunda, raportör grup tarafından yayılan flüoresan sinyali söndürme grubu tarafından emilir;PCR amplifikasyonu sırasında, Taq enziminin 5'-3' ekzonükleaz aktivitesi probu ayırır ve bozarak raportör floresan grubu ve söndürücü yapar Floresan grup ayrılır, böylece floresan izleme sistemi floresan sinyalini alabilir, yani her DNA sarmalı amplifiye edildiğinde bir floresan molekülü oluşur ve floresan sinyalinin birikimi PCR ürününün oluşumu ile tamamen senkronize olur.

2) SYBR floresan boyaları:

PCR reaksiyon sisteminde, fazla miktarda SYBR floresan boya eklenir.SYBR floresan boyası, DNA çift ipliğine spesifik olmayan bir şekilde dahil edildikten sonra, bir floresan sinyali yayar.Zincire dahil olmayan SYBR boya molekülü herhangi bir floresan sinyali yaymaz, böylece floresan sinyali sağlar. PCR ürünlerindeki artış, PCR ürünlerindeki artış ile tamamen senkronizedir.SYBR yalnızca çift sarmallı DNA'ya bağlanır, bu nedenle erime eğrisi, PCR reaksiyonunun spesifik olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

3) Moleküler işaretler

Bu, 5 ve 3 uçlarında yaklaşık 8 bazdan oluşan bir saç tokası yapısı oluşturan, kök halkalı çift etiketli bir oligonükleotit probu.Her iki uçtaki nükleik asit sekansları, flüoresan grubun ve söndürme grubunun sıkı olmasına neden olacak şekilde tamamlayıcı şekilde eşleştirilmiştir.Kapatın, floresan üretmeyecek.

PCR ürünü oluşturulduktan sonra, tavlama işlemi sırasında moleküler işaretçinin orta kısmı spesifik bir DNA dizisi ile eşleştirilir ve floresan gen, söndürücü genden ayrılarak floresans üretilir.

İkinci nesil PCR'nin ana dezavantajları:

Hassasiyet hala eksiktir ve düşük kopyalı numunelerin tespiti doğru değildir.

Arka plan değeri etkisi vardır ve sonuç girişime karşı hassastır.

Üçüncü nesil dijital PCR

Dijital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR), uç nokta tespiti yoluyla hedef sekansın kopya sayısını hesaplar ve dahili kontroller ve standart eğriler kullanmadan doğru mutlak kantitatif tespit gerçekleştirebilir.

Dijital PCR, uç nokta tespitini kullanır ve Ct değerine (döngü eşiği) bağlı değildir, bu nedenle dijital PCR reaksiyonu, amplifikasyon verimliliğinden daha az etkilenir ve PCR reaksiyon inhibitörlerine karşı tolerans, yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik ile iyileştirilir.

Yüksek hassasiyet ve yüksek doğruluk özelliklerinden dolayı, PCR reaksiyon inhibitörleri tarafından kolayca müdahale edilmez ve bir araştırma ve uygulama sıcak noktası haline gelen standart ürünler olmadan gerçek mutlak kantifikasyon elde edebilir.

Reaksiyon ünitesinin farklı formlarına göre mikroakışkan, çip ve damlacık sistemleri olmak üzere üç tipe ayrılabilir.