• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

1. RNA çözeltisinin emilimini tespit edin

280, 320, 230 ve 260 nm'deki soğurma sırasıyla nükleik asit, arka plan (çözelti bulanıklığı), tuz konsantrasyonu ve protein gibi organik madde değerlerini temsil eder.Genellikle sadece OD260/OD280'e bakın (Oran, R).1.8~2.0 olduğunda, RNA'daki protein veya diğer organik maddelerin kirlenmesinin tolere edilebileceğini düşünüyoruz, ancak absorbansı tespit etmek için tampon olarak Tris kullanıldığında, R değerinin 2'den büyük olabileceğine dikkat edilmelidir (genellikle <2.2 olmalıdır).R<1.8 olduğunda, çözeltideki protein veya diğer organik maddelerin kirliliği daha belirgindir ve ihtiyaçlara göre RNA'nın kaderi belirlenebilir.R>2.2 olduğunda, bu, RNA'nın tek nükleik aside hidrolize edildiği anlamına gelir.
 
2. RNA'nın elektroforetik modeli
Genel olarak, RNA elektroforezi için denatüre edici jel kullanılır, ancak yalnızca RNA'nın kalitesini tespit etmek içinse, denatüre edici jel gerekli değildir ve sıradan agaroz jeli kullanılabilir.Elektroforezin amacı, 28S ve 18S bantlarının bütünlüğünü ve oranlarını veya mRNA yaymasının bütünlüğünü tespit etmektir.Genel olarak, 28S ve 18S bantları parlak, net ve keskin (bantların kenarlarına atıfta bulunularak) ve 28S'nin parlaklığı 18S bandının iki katından fazla ise, RNA kalitesinin iyi olduğunu düşünüyoruz.
Yukarıdakiler yaygın olarak kullandığımız iki yöntemdir, ancak bu iki yöntemin hiçbiri bize RNA çözeltisinde artık RNaz olup olmadığını açıkça söyleyemez.Çözeltide çok az miktarda RNaz varsa yukarıdaki yöntemle tespit etmemiz zor ama sonraki enzimatik reaksiyonların çoğu 37 derecenin üzerinde ve uzun süre gerçekleştirilir.Bu sayede RNA solüsyonunda çok az miktarda RNaz varsa sonraki deneylerde rollerini oynamaları için çok uygun ortam ve zaman olacaktır ve tabi ki deney bu sırada soğuk olacaktır.Aşağıda, RNA çözeltisinde kalıntı RNaz olup olmadığını doğrulayabilen bir yöntem sunuyoruz.
 
3. Isı koruma testi
Numune konsantrasyonuna göre, RNA solüsyonundan iki adet 1000 ng RNA çekin ve bunu 0,5 ml'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve toplam hacmi 10 ul olacak şekilde pH 7,0 Tris tamponu ile tamamlayın ve ardından tüpün kapağını kapatın.Bunlardan birini 70°C'deki sabit sıcaklıktaki su banyosuna koyun ve 1 saat sıcak tutun.Diğer kısım -20°C buzdolabında 1 saat saklandı.Süre dolduğunda, elektroforez için iki örneği çıkarın.Elektroforez tamamlandıktan sonra, ikisinin elektroforetik bantlarını karşılaştırın.İkisinin bantları tutarlıysa veya önemli bir fark yoksa (elbette bantları da yöntem 2'deki koşulları karşılıyorsa), bu, RNA çözeltisinde artık RNaz kontaminasyonu olmadığı ve RNA'nın kalitesinin çok iyi olduğu anlamına gelir.Aksine, 70°C'de inkübe edilen numune bariz bozulma gösteriyorsa, bu RNA solüsyonunda RNaz kontaminasyonu olduğunu gösterir.
 
2 RNA ekstraksiyonu için deneysel yöntemler ve teknikler
RNA'yı çıkarırken sıklıkla karşılaştığımız sorunlar şunlardır: (1) RNA verimi düşüktür;(2) RNA ciddi tuz kirliliğine sahiptir;(3) RNA'nın ciddi organik çözücü kirliliği vardır;(4) numune bozulması ve diğer problemler
 
1. Yaygın olarak kullanılan toplam RNA ekstraksiyon reaktifleri
Guanidin izotiyosiyanat yöntemi ve Trizol yöntemi, hayvan dokularından ve hayvan hücrelerinden toplam RNA'nın ekstraksiyonu için en yaygın kullanılan yöntemlerdir.Tavşan derisinden ve hayvan bağ dokusundan toplam RNA'nın ekstraksiyonu gibi çıkarılması özellikle zor olan küçük numuneler ve dokular için özellikle uygundur;ayrıca genel amaçlı bir lizis reaktifi olan Trizol, bitki dokularının, bakterilerin, mantarların ve diğer dokuların ekstraksiyonu için de kullanılabilir.Kamelya oleifera, çay yaprakları, kolza tohumu vb. gibi polisakkaritler ve polifenoller içeren bitki dokuları için, toplam RNA'yı çıkarmak için CTAB yöntemi de kullanılabilir.

Geleneksel bir yöntem olarak, çift kolonlu yöntem de normal sıcaklıkta çalışması, RNaz eklemeye gerek olmaması ve ekstraksiyon için kloroform, fenoller ve diğer organik reaktifler içermemesi nedeniyle çok popülerdir.(önerilen ürünler )

1
2

2. Hayvan dokularından toplam RNA'nın çıkarılması
 
(1) Taze değilse, taze doku seçmeye çalışın (tercihen üç ay içinde - 80 ℃ buzdolabı veya sıvı nitrojen içinde donmuş. Dokuyu keserken, doğrudan oda sıcaklığında kesmeyin, buz kutusuna koyduğunuzdan emin olun, tekrarlanan donma ve çözülmeden kaçının.
(2) Küçük bir doku parçasını kesmek için temiz makas ve cımbız kullanın, numuneyi keserken dokunun orta kısmını kesmeye çalışın veya önce büyük doku parçasını ortasından kesin ve ardından numuneyi taze insizyon pozisyonunda kesin.Çıkarılan doku tamamen parçalanmalı, parçalanmış doku RNaz içermeyen bir EP tüpüne konulmalı, lizat eklenmeli, parçalanmış doku tamamen lizata maruz bırakılmalı ve homojenizasyon için hazırlanmalıdır.

(3) Normal dokular için homojenleştirme için maş fasulyesi büyüklüğünde dokular (30-60 mg) seçin.Dokular büyük miktarda protein, yağ veya karaciğer gibi yoğun fibröz dokular içeriyorsa, kesilen dokuların miktarını uygun şekilde artırın veya azaltın (isteğe bağlı) 10~20 mg seçin).
(4) Balık kası, karides eti, denizanası ve yüksek su içeriğine sahip diğer dokular çıkarılırsa, numune hacmi uygun şekilde artırılmalıdır (önerilen 100-200 mg).
(5) Koşullar izin verirse, hayvan dokusu, yüksek geçişli doku homojenizatörü ile homojenize edildikten sonra, eğer böyle bir ekipman yoksa, doğrudan ekstrakte edilebilir.
(6) Son ekstraksiyondan sonra elde edilen RNA, RNA'nın bozulmasını azaltmak için hemen buz kutusuna yerleştirilmelidir.

3. Hayvan hücresi RNA ekstraksiyonu

(1) Süspansiyon hücreleri: doğrudan santrifüjleyin ve ortamı atın, 1-2 kez steril PBS ile yıkayın, ardından uygun miktarda PBS ile süspanse edin ve ardından lizis için lizat ekleyin.Sıvıyı tamamen attıktan sonra çökelen hücrelere lizatı doğrudan eklemeyin.Bu, dış katmandaki parçalanmış hücrelerden sonra salınan histon paketinin çökelen hücrelerin dışına yapışmasına neden olacak ve böylece pelet içindeki hücrelerin lizat ile temasını sınırlayacaktır., eksik hücre lizisine ve düşük RNA verimine neden olur.

(2) Yarı yapışkan veya sıkıca yapışık olmayan hücreler: Ortamı attıktan sonra, 1-2 kez PBS ile yıkayın, ardından uygun miktarda PBS'yi doğrudan emdirin ve hücreleri üflemek için kültür kabını bir pipet veya tabanca ile üfleyin ve onları RNA'sız hücrelere aktarın.Ekstraksiyon için enzimin EP tüpüne lizat ekleyin.

(3) Yapışkan hücreler: önce tripsin ile sindirilmeli, ardından RNaz içermeyen EP tüplerinde toplanmalı, süpernatanı çıkarmak için santrifüjlenmeli, fazla tripsin çıkarmak için 1-2 kez PBS ile yıkanmalı ve uygun miktarda PBS ile yeniden süspanse edilmelidir. Ardından ekstraksiyon adımına geçin.

4. Bitki RNA ekstraksiyonu

Bitki dokuları fenolik bileşikler açısından zengindir veya polisakkaritler açısından zengindir veya bazı tanımlanamayan ikincil metabolitler içerir veya yüksek RNaz aktivitesine sahiptir.Bu maddeler, hücre parçalanmasından sonra RNA ile sıkı bir şekilde birleşerek, çıkarılması zor olan çözünmez kompleksler veya koloidal çökeltiler oluşturur.Bu nedenle bitki dokusunu çıkardığımız zaman bitkiler için bir kit seçmemiz gerekiyor.Kitteki lizat, polifenollerin kolay oksidasyonu ve polisakkarit bileşikleri ile nükleik asitlerin ayrılması sorunlarını etkili bir şekilde çözebilir.

(Polisakkarit polifenol bitki RNA ekstraksiyonu için önerilen ürünler:

(1) Bitkinin kabuğu, posası, tohumları, yaprakları vb. tamamen havanda öğütülmelidir.Öğütme işlemi sırasında numunenin erimesini önlemek için sıvı nitrojen zamanında doldurulmalıdır.Öğütülmüş numune hızla lizata eklenmeli ve RNA bozulmasını önlemek için çalkalanmalıdır.

(2) Pirinç ve buğday yaprakları gibi lif açısından zengin numuneler için ekstraksiyon miktarı uygun şekilde azaltılmalıdır, aksi takdirde doku öğütme ve parçalama tamamlanmaz ve ekstrakte edilen RNA veriminin düşük olmasına neden olur.

(3) Nar meyvesi, karpuz meyvesi, şeftali meyvesi vb. gibi yüksek su içeriğine sahip bitki dokuları için numune boyutu uygun şekilde artırılmalıdır (100-200 mg isteğe bağlıdır).

(4) Bitki yaprakları, rizomlar, sert meyveler ve diğer malzemeler gibi bitki dokularının, malzemeleri bir havanda iyice harçlamak için sıvı nitrojen kullanması ve ardından ekstraksiyon adımına geçmesi tavsiye edilir.Geleneksel doku homojenleştiriciler, bitki dokularının homojenleştirilmesinde etkili olmayabilir ve genellikle tavsiye edilmez.

5. RNA ekstraksiyonu için önlemler

(1) Tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için doku numuneleri mümkün olduğu kadar taze olmalıdır.

(2) Çekim sırasında doku tamamen öğütülmeli ve doku miktarı çok fazla olmasın, çok az da olmamalıdır.

(3) Örneği tamamen parçalamak için lizat eklendikten sonra yeterli inkübasyon süresi verilmelidir.

(4) Ekstraksiyon için Trizol yöntemini kullanırken, tabakalaşmadan sonra süpernatantın emilmesi ilkesi "daha fazla solumaktansa daha az solumayı tercih edin" ve orta katmana özütlenmemelidir, aksi takdirde ciddi genomik DNA kontaminasyonuna neden olur.

(5) Yıkarken, tam yıkamayı sağlamak için yıkama sıvısı boru duvarının çevresine tamamen sızmalıdır.

(6) Kolon ekstraksiyon yöntemi için, yıkamadan sonra kolonun ayrılmasına ek olarak, adsorpsiyon kolonu da ultra temiz bir tezgaha yerleştirilmeli ve organik çözücünün kuruyana kadar tamamen buharlaşması için 5-10 dakika üflenmelidir.

(7) Kolon yönteminin son elüsyonunda DEPC suyu eklendikten sonra 3-5 dakika inkübe edilmeli veya elüsyon verimini artırmak için DEPC suyu önceden 60°C'ye ısıtılmalıdır.Geleneksel Trizol parçalama ve izopropanol çöktürme yönteminde, son RNA DEPC su içinde çözülür, bu nedenle çözünme için uygun bir süre verilmeli ve santrifüj tüpünün tabanı bir pipet ucu ile sürekli olarak üflenmelidir.

3 TÜç Düşük RNA konsantrasyonu/düşük kalite için nedenler ve çözümler
 
1. Verim çok düşük
Ekstre edilen numune çok düşük, toplam miktar yetersiz veya ekstrakte edilen numune çok fazla ve lizis tamamlanmadı;ekstraksiyon için uygun kalitede doku veya hücreler kullanılmalı, örneğin ön işlemi iyi yapılmalı ve lizis yeterli olmalıdır.
 
2. Genom kalıntıları
Trizol yöntemi ile ekstraksiyon yapılırken, katmanlama sonrası süpernatant orta katmana çekildiğinde ciddi genom kontaminasyonuna neden olunacak;Orta tabakanın içine çekilmemesi için tabakalama yapılırken ekstra özen gösterilmelidir.Ekstraksiyon için kolon yöntemi kullanılıyorsa, ekstraksiyon için DNase I içeren bir kit seçilebilir.Zar üzerinde adsorbe edilen nükleik asit, DNA kalıntılarını büyük ölçüde azaltabilen DNase I ile doğrudan sindirilir.
 
3. RNA bozulması
Ekstre edilen numunenin bozunması veya ekstraksiyon işlemi sırasında oluşan bozunma olabilir;RNA ekstraksiyonu için mümkün olduğunca taze numuneler kullanılmalı, toplanan numuneler sıvı nitrojen veya -80°C buzdolabında zamanında saklanmalı, tekrar tekrar dondurma ve çözme işleminden kaçınılmalıdır.RNA ekstraksiyon işleminde RNaz/DNaz içermeyen uçlar, santrifüj tüpleri ve diğer malzemeler kullanılmalıdır.Ekstraksiyon işlemi mümkün olduğu kadar hızlı olmalıdır.Ekstre edilen RNA bir buz kutusuna yerleştirilmeli ve -80'de saklanmalıdır.Ekstrakte edilen RNA'nın jel elektroforezi ile tespit edilmesi gerekiyorsa, ekstraksiyondan hemen sonra elektroforez yapılmalı ve elektroforez tamponu yeni hazırlanmış olanla değiştirilmelidir.
 
4. Tuz ve organik solvent kalıntıları
Ekstraksiyon reaktifleri fenol ve guanidin tuzları içerir ve yıkama solüsyonu etanol içerir.Ekstraksiyon işlemi sırasında, lizat tamamen emilip atılmadı ve yıkama solüsyonu tamamen kurutulmadı.Kalıntı tuzlar ve organik çözücüler sonraki ters transkripsiyon ve PCR için zararlıdır.Farklı inhibisyon dereceleri, bu nedenle ekstraksiyon işlemi sırasında doku lizatı tamamen çıkarılmalı ve yıkama, tüpü çevreleyen duvarların yıkanabilmesi için yeterli olmalıdır.Ayrıca tüpün boşaltılması ve üflenmesi gerekli bir adımdır, bu da organik madde kalıntısını daha da azaltacaktır.
 
RNA ekstraksiyonu hakkında daha fazla bilgi için lütfen web sitemizi takip edin:
Daha fazla bilgi için www.foreivd.com.

7

Gönderim zamanı: Aralık-01-2022