Ct değeri, floresan kantitatif PCR'nin en önemli sonuç sunum şeklidir.Gen ekspresyon farklılıklarını veya gen kopya sayısını hesaplamak için kullanılır.Peki, makul kabul edilen floresan miktarının Ct değeri nedir?Etkili Ct değeri aralığı nasıl sağlanır?
Ct Değeri Nedir?
qPCR amplifikasyon işlemi sırasında, amplifiye edilen ürünün floresan sinyali ayarlanan floresan eşiğine ulaştığında karşılık gelen amplifikasyon döngüsü sayısı (Döngü Eşiği).C, Döngü anlamına gelir ve T, Eşik anlamına gelir.Basitçe söylemek gerekirse, Ct değeri, ilk şablon amplifikasyonunun qPCR'de belirli bir ürün miktarına ulaştığı zamana karşılık gelen döngü sayısıdır.Sözde "belirli miktarda ürün" daha sonra açıklanacaktır.
Ct değeri ne işe yarar?
1. Üstel büyütme, şablon miktarı ve Ct değeri arasındaki ilişki
İdeal olarak, qPCR'deki genler, belirli sayıda döngüden sonra üstel amplifikasyonla toplanır.Amplifikasyon döngülerinin sayısı ile ürün miktarı arasındaki ilişki şu şekildedir: Amplifiye ürün miktarı = ilk şablon miktarı × (1+En) döngü sayısı.Ancak qPCR reaksiyonu her zaman ideal durumda değildir.Amplifiye edilen ürün miktarı “belirli bir ürün miktarına” ulaştığında bu andaki döngü sayısı Ct değeridir ve üssel amplifikasyon periyodundadır.Ct değeri ile başlangıç şablonu miktarı arasındaki ilişki: Şablonun Ct değeri ile şablonun başlangıç kopya sayısının logaritması arasında doğrusal bir ilişki vardır.İlk şablon konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, Ct değeri o kadar küçük olur;başlangıç şablon konsantrasyonu ne kadar düşükse, Ct değeri o kadar büyük olur.
2. Amplifikasyon eğrisi, floresan eşiği ve belirli PCR ürün miktarı
qPCR amplifikasyon ürününün miktarı doğrudan floresan sinyali, yani amplifikasyon eğrisi şeklinde sunulur.PCR'nin erken aşamasında amplifikasyon ideal koşullar altındadır, döngü sayısı azdır, ürün birikimi azdır ve floresan seviyesi floresan arka plandan net bir şekilde ayırt edilemez.Bundan sonra floresans artar ve üstel faza girer.PCR ürününün miktarı, “belirli bir ürün miktarı” olarak kullanılabilen PCR reaksiyonunun tam üstel fazda olduğu belirli bir noktada tespit edilebilir ve şablonun başlangıç içeriği buradan çıkarılabilir.Bu nedenle, belirli bir ürün miktarına karşılık gelen floresan sinyal yoğunluğu, floresans eşiğidir.
PCR'nin geç aşamasında, amplifikasyon eğrisi artık üstel amplifikasyon göstermez ve lineer faza ve plato fazına girer.
3. Ct değerlerinin tekrar üretilebilirliği
PCR döngüsü, Ct değerinin döngü sayısına ulaştığında, gerçek üssel amplifikasyon dönemine girmiş demektir.Şu anda, küçük hata büyütülmemiştir, bu nedenle Ct değerinin tekrar üretilebilirliği mükemmeldir, yani aynı şablon farklı zamanlarda veya farklı tüplerde aynı anda büyütülür.Amplifikasyon, elde edilen Ct değeri sabittir.
1. Amplifikasyon verimliliği Tr
PCR amplifikasyon verimliliği, polimerazın amplifiye edilecek geni bir amplikona dönüştürme verimliliği anlamına gelir.Bir DNA molekülü iki DNA molekülüne dönüştürüldüğünde amplifikasyon verimliliği %100'dür.Amplifikasyon verimliliği genellikle En olarak ifade edilir.Sonraki makalelerin analizini kolaylaştırmak için amplifikasyon verimliliğini etkileyen faktörler kısaca tanıtılmıştır.
| Etkileyen faktörler | açıklama | Nasıl yargılanır? |
| A. PCR inhibitörleri | 1. Şablon DNA, proteinler veya deterjanlar gibi PCR reaksiyonunu engelleyen maddeler içerir.2. Ters transkripsiyondan sonraki cDNA, sonraki PCR reaksiyonunu da inhibe edebilen yüksek konsantrasyonda şablon RNA veya RT reaktif bileşenleri içerir. | 1. Kirlilik olup olmadığı, A260/A280 ve A260/A230 oranı veya RNA elektroforezi ölçülerek değerlendirilebilir.2. Ters transkripsiyondan sonra cDNA'nın belirli bir orana göre seyreltilmiş olup olmadığı. |
| B. Uygun olmayan astar tasarımı | Astarlar verimli bir şekilde tavlanmaz | Primerleri primer-dimerler veya saç tokaları, uyumsuzluklar ve bazen yayılan intronik tasarımlar için kontrol edin. |
| C. Uygun olmayan PCR reaksiyon programı tasarımı | 1. Astarlar etkili bir şekilde tavlanamaz2. Yetersiz DNA polimeraz salınımı 3. Uzun süreli yüksek sıcaklıkta DNA polimeraz aktivitesi azaldı | 1. Tavlama sıcaklığı astarın TM değerinden yüksek2. Ön denatürasyon süresi çok kısa 3. Reaksiyon prosedürünün her aşamasının süresi çok uzun |
| D. Reaktiflerin yetersiz karıştırılması veya pipetleme hataları | Reaksiyon sisteminde, PCR reaksiyon bileşenlerinin yerel konsantrasyonu çok yüksek veya düzensiz, bu da PCR amplifikasyonunun üssel olmayan amplifikasyonuna neden oluyor | |
| E. Amplikon Uzunluğu | Amplikonun uzunluğu çok uzun, 300bp'yi aşıyor ve amplifikasyon verimliliği düşük | Amplikon uzunluğunun 80-300bp arasında olduğunu kontrol edin |
| F. qPCR reaktiflerinin etkisi | Reaktifteki DNA polimeraz konsantrasyonu düşüktür veya tampondaki iyonların konsantrasyonu optimize edilmemiştir, bu da Taq enzim aktivitesinin maksimuma ulaşmamasına neden olur | Amplifikasyon verimliliğinin standart eğri ile belirlenmesi |
2. Ct değerleri aralığı
Ct değerleri 15-35 aralığındadır.Ct değeri 15'in altındaysa amplifikasyonun başlangıç periyodu aralığında olduğu ve floresans eşiğine ulaşılmadığı kabul edilir.İdeal olarak, Ct değeri ile şablonun ilk kopya numarasının logaritması, yani standart eğri arasında doğrusal bir ilişki vardır.Standart eğri aracılığıyla, amplifikasyon verimliliği %100 olduğunda, genin tek kopya sayısını ölçmek için hesaplanan Ct değeri 35 civarındadır. 35'ten büyükse, şablonun ilk kopya sayısı teorik olarak 1'den azdır ve bu anlamsız kabul edilebilir.
Farklı gen Ct aralıkları için, başlangıç şablon miktarındaki gen kopya sayısı ve amplifikasyon etkinliğindeki farklılık nedeniyle, gen için standart bir eğri yapmak ve genin lineer tespit aralığını hesaplamak gerekir.
3. Ct değerini etkileyen faktörler
Amplifikasyon döngü sayısı ile ürün miktarı arasındaki ilişkiden: amplifiye ürün miktarı = ilk şablon miktarı × (1+En) döngü sayısı, ideal koşullar altında başlangıç şablonu miktarının ve En'in Ct değeri üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacağı görülebilir.Şablon kalitesindeki veya amplifikasyon verimliliğindeki fark, Ct değerinin çok büyük veya çok küçük olmasına neden olur.
4.Ct değeri çok büyük veya çok küçük
Gönderim zamanı: 22 Şubat 2023
