PCR, en yaygın kullanılan nükleik asit amplifikasyon teknolojisidir ve duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır.Bununla birlikte, PCR, tekrarlanan termal denatürasyon gerektirir ve klinik saha testlerinde uygulamasını sınırlayan alet ve ekipmana güvenmenin sınırlamalarından kurtulamaz.

1990'ların başından beri birçok laboratuvar, termal denatürasyon gerektirmeyen sabit sıcaklıkta amplifikasyon teknolojisi geliştirmeye başlamıştır.Şimdi döngü aracılı izotermal amplifikasyon teknolojisi, sarmal değiştirme izotermal amplifikasyon teknolojisi, yuvarlanan daire izotermal amplifikasyon teknolojisi ve nükleik asit dizisi bağımlılığı geliştirdiler.İzotermal amplifikasyon teknolojisi ve diğer teknolojiler. 

Loop aracılı izotermal amplifikasyon

Amplifikasyon ilkesi, DNA'nın yaklaşık 65°C'de dinamik bir denge durumunda olduğu gerçeğine dayanır.Herhangi bir primer baz eşlendiğinde ve çift sarmallı DNA'nın tamamlayıcı kısmına uzatıldığında, diğer sarmal ayrışır ve tek sarmal olur.

Bu sıcaklıkta DNA, iplik yer değiştirme DNA'sının sentezini sürekli olarak kendi kendine dolaştırmasını sağlamak için bir iplik yer değiştirme DNA polimerazına güvenmek için 4 spesifik primer kullanır.

Önce hedef gen üzerindeki 6 spesifik bölgeyi F3, F2, F1, B1, B2, B3 belirleyin ve ardından bu 6 spesifik bölgeye göre 4 primer tasarlayın (aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi):

İleri iç astar (FIP), F1c ve F2'den oluşur.

Geri iç astar (BIP), B1c ve B2'den oluşur ve TTTT, ortada bir ayırıcı olarak kullanılır.

Dış primerler F3 ve B3, sırasıyla hedef gen üzerindeki F3 ve B3 bölgelerinden oluşur.

LAMP reaksiyon sisteminde, iç primerin konsantrasyonu dış primerin birkaç katıdır.İçteki primer, bir DNA çift sarmalı oluşturmak üzere tamamlayıcı bir sarmalı sentezlemek için önce kalıp sarmal ile birleştirilir.Daha sonra, dış primer, bir DNA çift sarmalı oluşturmak üzere kalıp sarmal ile birleştirilir.BstDNA polimerazın etkisi altında, iç primer tarafından sentezlenen tamamlayıcı zincir salınır.Bir dizi reaksiyondan sonra, tamamlayıcı sarmal nihayet bir dambıl yapıya sahip tek bir DNA sarmalı oluşturur.

Dambıl yapısı DNA tek sarmalının kendisi, açık uçlu bir geçiş kök-ilmek yapısı DNA'sını sürekli olarak oluşturmak için bir şablon olarak kullanılır.İç ve dış primerler, geçiş kök ilmek yapısı DNA'sının sürekli olarak sarmal yer değiştirme ve uzatma reaksiyonlarına girmesine ve sonunda farklı uzunluklarda çoklu kök ilmek yapıları oluşturmasına rehberlik eder.DNA karışımı.

Döngü aracılı izotermal amplifikasyonun avantajları ve dezavantajları

LAMP'ın Avantajları:

(1) Hedef genin 1-10 kopyasını 1 saat içinde etkili bir şekilde çoğaltabilen yüksek amplifikasyon verimliliği ve amplifikasyon verimliliği, sıradan PCR'nin 10-100 katıdır.

(2) Reaksiyon süresi kısadır, özgüllüğü yüksektir ve özel ekipman gerekmez.

LAMP'ın eksiklikleri:

(1) Astarlar için gereksinimler özellikle yüksektir.

(2) Güçlendirilmiş ürün, klonlama ve dizileme için kullanılamaz, yalnızca yargılama için kullanılabilir.

(3) Güçlü hassasiyeti nedeniyle, yanlış pozitiflere neden olan ve test sonuçlarını etkileyen aerosoller oluşturmak kolaydır.

Strend yer değiştirme amplifikasyonu

Strand deplasman amplifikasyonu (SDA), ilk olarak 1992'de Amerikalı akademisyen Walker tarafından önerilen enzimatik reaksiyona dayalı bir in vitro izotermal DNA amplifikasyon tekniğidir.

SDA'nın temel sistemi, bir kısıtlama endonükleazı, zincir yer değiştirme aktivitesine sahip bir DNA polimerazı, iki çift primer, dNTP'ler ve kalsiyum ve magnezyum iyonları ve tampon sistemlerini içerir.

İplik yer değiştirme amplifikasyonunun prensibi, hedef DNA'nın her iki ucundaki kimyasal olarak değiştirilmiş restriksiyon endonükleaz tanıma dizisine dayanır.Endonükleaz, DNA sarmalındaki boşluğu tanıma yerinde açar ve DNA polimeraz, boşluğu 3' Uzatır ve bir sonraki DNA sarmalının yerini alır.

DNA'nın değiştirilen tek sarmalları, primerlerle birleştirilebilir ve DNA polimeraz tarafından çift sarmallara uzatılabilir.Bu işlem sürekli olarak tekrarlanır, böylece hedef dizi verimli bir şekilde çoğaltılır.

Tel yer değiştirme amplifikasyon teknolojisinin avantajları ve dezavantajları

SDA'nın Avantajları:

Amplifikasyon verimliliği yüksektir, reaksiyon süresi kısadır, özgüllük güçlüdür ve özel ekipman gerektirmez.

SDA'nın eksiklikleri:

Ürünler tekdüze değildir ve bazı tek sarmallı ve çift sarmallı ürünler her zaman SDA döngüsünde üretilir ve elektroforez ile tespit edildiğinde kaçınılmaz olarak kuyruk oluşur.

Rdönen daire amplifikasyonu

Yuvarlanan daire amplifikasyonu (RCA), yuvarlanan daire ile patojenik organizmalardan DNA kopyalama yönteminden yararlanılarak önerilmiştir.Sabit bir sıcaklıkta bir şablon olarak tek sarmallı dairesel DNA'nın ve özel bir DNA polimerazın (Phi29 gibi) kullanımını ifade eder. Hedef genin amplifikasyonunu sağlamak için yuvarlanan daire DNA sentezinin etkisi altında.

RCA, lineer amplifikasyon ve üstel amplifikasyon olarak ikiye ayrılabilir.Doğrusal RCA'nın verimliliği 10'a ulaşabilir⁵kez ve üstel RCA'nın verimliliği 10'a ulaşabilir⁹zamanlar.

Basit ayrım, aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, lineer amplifikasyon a sadece 1 primer kullanır, üstel amplifikasyon b ise 2 primer kullanır.

Doğrusal RCA ayrıca tek primer RCA olarak da adlandırılır.Bir primer dairesel DNA'ya bağlanır ve DNA polimerazın etkisiyle uzar.Ürün, tek bir ilmek uzunluğunun binlerce katı uzunluğunda çok sayıda tekrar eden diziye sahip doğrusal tek bir iplikçiktir.

Doğrusal RCA'nın ürünü her zaman başlangıç ​​primerine bağlı olduğundan, sinyalin kolay sabitlenmesi büyük bir avantajdır.

Üstel RCA, Hiper dallı amplifikasyon HRCA (Hiper dallı RCA) olarak da bilinir, üstel RCA'da, bir primer RCA ürününü yükseltir, ikinci primer RCA ürünü ile hibritleşir ve uzar ve ikame zaten RCA ürününe bağlıdır. Aşağı akış primerleri sarmalı uzatır ve bir dendritik RCA amplifikasyon ürünü üretmek için uzatma ve değiştirmeyi tekrarlar.

Yuvarlanan daire nükleik asit amplifikasyonunun avantajları ve dezavantajları

RCA'nın Avantajları:

Yüksek hassasiyet, iyi özgüllük ve kolay kullanım.

RCA'nın eksiklikleri:

Sinyal tespiti sırasında arka plan sorunları.RCA reaksiyonu sırasında, sirküle edilmemiş asma kilit probu ve bağlanmamış probun şablon DNA'sı veya RNA'sı bazı arka plan sinyalleri üretebilir. 

Nnükleik asit dizisine dayalı amplifikasyon

Nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyon (NASBA), PCR temelinde geliştirilen yeni bir teknolojidir.Bir T7 promotör dizisine sahip bir çift primer tarafından yönlendirilen sürekli ve izotermal bir nükleik asit amplifikasyonudur.Teknoloji, şablon RNA'yı yaklaşık 2 saat içinde yaklaşık 109 kat çoğaltabilir, bu da geleneksel PCR yönteminden 1000 kat daha yüksektir ve özel ekipman gerektirmez.

Bu teknoloji ortaya çıktığı anda hastalıkların hızlı teşhisi için kullanılmaya başlandı ve şu anda birçok şirket RNA tespit kitlerinde bu yöntemi kullanıyor.

RNA amplifikasyonu, ters transkripsiyon PCR teknolojisini de kullanabilse de, NASBA'nın kendi avantajları vardır: nispeten sabit sıcaklık koşulları altında gerçekleştirilebilir ve geleneksel PCR teknolojisinden daha kararlı ve doğrudur.

Reaksiyon 41 santigrat derecededir ve tamamlanması için AMV (kuş miyeloblastoz virüsü) ters transkriptaz, RNaz H, T7 RNA polimeraz ve bir çift primer gerektirir.

Süreç esas olarak şunları içerir:

İleri primer, T7 promotörünün tamamlayıcı dizisini içerir.Reaksiyon sırasında ileri primer, RNA sarmalına bağlanır ve bir DNA-RNA çift sarmalı oluşturmak üzere AMV enzimi tarafından katalize edilir.

RNase H, hibrit çift sarmaldaki RNA'yı sindirir ve tek sarmallı DNA'yı tutar.

Ters primer ve AMV enziminin etkisi altında, T7 promotör dizisini içeren bir DNA çift sarmalı oluşur.

T7 RNA polimerazın etkisi altında, transkripsiyon işlemi tamamlanır ve büyük miktarda hedef RNA üretilir.

NASBA'nın Avantajları:

(1) Primeri bir T7 promotör sekansına sahiptir, ancak yabancı çift sarmallı DNA'nın T7 promotör sekansı yoktur ve amplifiye edilemez, bu nedenle bu teknolojinin yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı vardır.

(2) NASBA, ters transkripsiyon sürecini amplifikasyon reaksiyonuna doğrudan dahil ederek reaksiyon süresini kısaltır.

NASBA'nın dezavantajları:

(1) Reaksiyon bileşenleri daha karmaşıktır.

(2) Reaksiyon maliyetini yükseltmek için üç çeşit enzim gereklidir.