• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

Aklımdaki tespit teknolojisi tarihindeki birkaç devrim niteliğindeki icat, antijen-antikor spesifik bağlanma ilkesine dayanan immüno etiketleme teknolojisi, PCR teknolojisi ve dizileme teknolojisidir.Bugün PCR teknolojisinden bahsedeceğiz.PCR teknolojisinin gelişimine göre, insanlar alışılmış bir şekilde PCR teknolojisini üç nesle ayırır: sıradan PCR teknolojisi, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR teknolojisi ve dijital PCR teknolojisi.

Common PCR tekniği

w1

KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)

Kary Mullis, 1983 yılında polimeraz zincir reaksiyonunu (polimeraz zincir reaksiyonu, PCR) icat etti. Kız arkadaşını araba kullanırken, birdenbire aklına bir ilham geldi ve PCR prensibini (araba sürmenin faydaları üzerine) düşündü.Kary Mullis, 1993 yılında Kimya dalında Nobel Ödülü'ne layık görüldü. New York Times şu yorumu yaptı: "Son derece özgün ve anlamlı, biyolojiyi neredeyse PCR öncesi ve PCR sonrası dönemlere ayırıyor.

PCR prensibi: DNA polimerazın katalizi altında, ana iplikçik DNA'sı şablon olarak kullanılır ve spesifik primer, uzatmanın başlangıç ​​noktası olarak kullanılır ve ana iplikçik şablon DNA'sını tamamlayıcı olan kız iplikçik DNA'sı, in vitro olarak denatürasyon, tavlama, uzatma ve diğer adımlar yoluyla kopyalanır.Herhangi bir hedef DNA'yı in vitro hızla ve spesifik olarak amplifiye edebilen in vitro bir DNA sentezi amplifikasyon teknolojisidir.

w2

Sıradan PCR'nin avantajları
1.Klasik yöntem, eksiksiz uluslararası ve yerel standartlar
2.Cihaz reaktiflerinin daha düşük maliyeti
3.PCR ürünleri, diğer moleküler biyoloji deneyleri için geri kazanılabilir
Önerilen Foregene PCR makinesi: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
İlgili ürünler: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Sıradan PCR'nin dezavantajları
1.kirletmesi kolay
2.hantal operasyon
3.sadece nitel analiz
4.orta hassasiyet
5.Spesifik olmayan amplifikasyon vardır ve spesifik olmayan bant, hedef bant ile aynı boyutta olduğunda ayırt edilemez.
 
Ckılcal elektroforez tabanlı PCR
Sıradan PCR'nin eksikliklerine yanıt olarak, bazı üreticiler kapiler elektroforez ilkesine dayalı cihazlar geliştirmiştir.PCR amplifikasyonundan sonraki elektroforez adımı kılcal damarda tamamlanır.Duyarlılık daha yüksektir ve birkaç bazın farkı ayırt edilebilir ve büyütme MAERKER tarafından hesaplanabilir.ürün içeriği.Dezavantajı ise PCR ürününün yine de açılıp alete konulması gerekiyor ve yine de büyük bir kontaminasyon riski var.

w3

CkılcalEelektroforez

 

2. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR (Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR, qPCR) teknolojisiReal-Time PCR olarak da adlandırılan floresan kantitatif PCR, PE (Perkin Elmer) tarafından 1995 yılında geliştirilen yeni bir nükleik asit kantitatif teknolojisidir.Eğer ilgileniyorsanız, kontrol edebilirsiniz.Bu teknik şu anda en olgun ve yaygın olarak kullanılan yarı kantitatif PCR tekniğidir.

Önerilen qPCR Makinesi: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Floresan boya yöntemi (SYBR Green I):SYBR Green I, spesifik olmayan şekilde çift sarmallı DNA'ya bağlanan kantitatif PCR için en yaygın kullanılan DNA bağlayıcı boyadır.Serbest durumda, SYBR Green zayıf flüoresans yayar, ancak çift sarmallı DNA'ya bağlandıktan sonra flüoresansı 1000 kat artar.Bu nedenle, bir reaksiyon tarafından yayılan toplam floresan sinyali, mevcut çift sarmallı DNA miktarı ile orantılıdır ve amplifiye edilen ürünün artmasıyla artacaktır.Boya, çift sarmallı DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlandığından, yanlış pozitif sonuçlar üretilebilir.

İlgili ürünler: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Floresan prob yöntemi (Taqman teknolojisi): SırasındaPCR amplifikasyonu, bir çift primer ile aynı zamanda spesifik bir floresan probu eklenir.Prob, sırasıyla her iki ucunda etiketlenmiş bir flüoresan raportör grubu ve bir flüoresan söndürücü grubu olan lineer bir oligonükleotiddir.Prob bozulmamış olduğunda, raportör grup tarafından yayılan flüoresan sinyali söndürücü grup tarafından emilir ve algılama Floresan sinyali yok;PCR amplifikasyonu sırasında (uzatma aşamasında), Taq enziminin 5'-3' Dicer aktivitesi probu sindirecek ve bozacaktır, böylece raportör floresan grubu ve söndürücü floresan grubu ayrılır, böylece floresan izleme sistemi Floresan sinyali alınabilir, yani bir DNA zinciri her amplifiye edildiğinde, floresan sinyallerinin birikimi ve PCR ürünlerinin oluşumunun tam senkronizasyonunu gerçekleştiren bir floresan molekülü oluşur.Taqman prob yöntemi, klinik tespitte en sık kullanılan tespit yöntemidir.

İlgili ürünler: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

w4

qPCR'nin Avantajları
1.Yöntem olgunlaştı ve destekleyici ekipman ve reaktifler tamamlandı
2.Orta reaktif maliyeti
3.kullanımı kolay
4.Yüksek algılama hassasiyeti ve özgüllüğü
 
qPCR'nin dezavantajları

Hedef genin mutasyonu, tespitin kaçırılmasına yol açar.
Düşük konsantrasyonlu şablonun algılama sonucu belirlenemez.
Kantitatif saptama için standart eğri kullanılırken büyük bir hata vardır.
 
3. Dijital PCR (dijital PCR, dPCR) teknolojisi
Dijital PCR, nükleik asit moleküllerinin mutlak miktar tayini için bir tekniktir.qPCR ile karşılaştırıldığında dijital PCR, başlangıç ​​örneğindeki nükleik asit moleküllerinin mutlak ölçümü olan DNA/RNA moleküllerinin sayısını doğrudan okuyabilir.1999'da Bert Vogelstein ve Kenneth W. Kin-zler, dPCR kavramını resmen önerdiler.
 
2006 yılında Fluidigm, ticari bir çip tabanlı dPCR cihazı üreten ilk şirket oldu.Life Technologies, 2009 yılında OpenArray ve QuantStudio 12K Flex dPCR sistemlerini piyasaya sürdü.2013 yılında Life Technologies, numuneleri 20.000 ayrı hücreye eşit şekilde dağıtmak için yüksek yoğunluklu nano ölçekli mikroakışkan çip teknolojisini kullanan QuantStudio 3DdPCR sistemini piyasaya sürdü.reaksiyonda iyi.

w5

2011'de Bio-Rad, numuneyi 20.000 yağda su damlasına eşit olarak dağıtmak için yağda su teknolojisini kullanan ve damlacıkları analiz etmek için bir damlacık analizörü kullanan damlacık tabanlı QX100 dPCR cihazını piyasaya sürdü.2012'de RainDance, her bir standart reaksiyon sistemini 1 ila 10 milyon pikolitre düzeyinde mikro damlacık içeren bir reaksiyon emülsiyonuna bölmek için yüksek basınçlı gazla çalışan RainDrop dPCR cihazını piyasaya sürdü.

w6

Şimdiye kadar dijital PCR, çip tipi ve damlacık tipi olmak üzere iki ana grup oluşturmuştur.Ne tür bir dijital PCR olursa olsun, temel ilkeleri dilüsyon sınırlaması, son nokta PCR ve Poisson dağılımıdır.Nükleik asit şablonları içeren standart PCR reaksiyon sistemi, çiplere veya mikro damlacıklara dağıtılan on binlerce PCR reaksiyonuna eşit olarak bölünür, böylece her reaksiyon mümkün olduğu kadar çok şablon molekül içerir ve tek moleküllü bir şablon PCR reaksiyonu gerçekleştirilir.Floresans okuyarak Sinyalin varlığı veya yokluğu sayılır ve istatistiksel Poisson dağılımının kalibrasyonundan sonra mutlak ölçüm gerçekleştirilir.

Aşağıdakiler, kullandığım birkaç dijital PCR platformunun özellikleridir:

1. Bio-Rad QX200 damlacık dijital PCR Bio-RadQX200 çok klasik bir dijital PCR platformudur, temel tespit süreci: damlacık üreteci tarafından 20.000 numune üretilir Yağda su mikro damlacıkları sıradan bir PCR makinesinde yükseltilir ve son olarak her bir mikro damlacığın floresan sinyali bir mikro damlacık okuyucu tarafından okunur.Operasyon daha karmaşıktır ve kirlilik riski orta düzeydedir.

w7

Xinyi TD1 mikro damlacık dijital PCRXinyi TD1 yerli bir dijital PCR platformudur, temel tespit süreci: bir damlacık üreteci aracılığıyla 30.000-50.000 yağda su damlacığı üretir, ortak bir PCR cihazında çoğaltır ve sonunda geçer Damlacık okuyucu, her bir damlacığın floresan sinyalini okur.Bu platformda hem damlacık üretimi hem de okuma, düşük kontaminasyon riski olan özel bir çipte gerçekleştirilir.

w8

 STILLA Naica mikro damlacık çip dijital PCRSTILLA Naica nispeten yeni bir dijital PCR platformudur.Temel tespit süreci şu şekildedir: reaksiyon solüsyonunu çipe ekleyin, çipi mikro damlacık oluşturma ve amplifikasyon sistemine yerleştirin ve 30.000 mikro damlacık oluşturun.Çip üzerine yayılır ve çip üzerinde PCR amplifikasyonu tamamlanır.Daha sonra güçlendirilmiş çip mikro damlacık okuma analiz sistemine aktarılır ve floresan sinyal fotoğraflanarak okunur.Tüm süreç kapalı bir çipte gerçekleştiği için kontaminasyon riski düşüktür.

w9

4. ThermoFisher QuantStudio 3D çip dijital PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D, başka bir klasik çip tabanlı dijital PCR platformudur.Temel tespit süreci şu şekildedir: reaksiyon solüsyonunu yayıcıya ekleyin ve reaksiyon solüsyonunu yayıcı aracılığıyla 20.000 mikrokuyu ile çip üzerine eşit şekilde yayın., amplifiye etmek için çipi PCR makinesine koyun ve son olarak çipi okuyucuya yerleştirin ve floresan sinyali okumak için bir fotoğraf çekin.Operasyon nispeten karmaşıktır ve tüm süreç kapalı bir çipte gerçekleştirilir ve kontaminasyon riski düşüktür.

w10

5. JN MEDSYS Clarity çip dijital PCR

JN MEDSYS Clarity, nispeten yeni bir çip tipi dijital PCR platformudur.Temel tespit süreci şu şekildedir: reaksiyon solüsyonunu aplikatöre ekleyin ve reaksiyon solüsyonunu aplikatör aracılığıyla PCR tüpüne sabitlenmiş 10.000 PCR tüpüne eşit şekilde yayın.Mikrogözenekli çip üzerinde, reaksiyon solüsyonu kılcal hareket yoluyla çipe girer ve çipin bulunduğu PCR tüpü amplifikasyon için PCR makinesine yerleştirilir ve son olarak çip okuyucuya konur ve fotoğraf çekilerek floresan sinyali okunur.Operasyon daha karmaşıktır.Kontaminasyon riski düşüktür.

w11

Her bir dijital PCR platformunun parametreleri aşağıdaki şekilde özetlenmiştir:

w12

Dijital PCR platformunun değerlendirme göstergeleri şunlardır: bölünmüş birimlerin sayısı, flüoresan kanalların sayısı, işlemin karmaşıklığı ve kontaminasyon riski.Ancak en önemli şey algılama doğruluğudur.Dijital PCR platformlarını değerlendirmenin bir yolu, birbirini doğrulamak için birden fazla dijital PCR platformu kullanmak, başka bir yol da doğru değerlere sahip standart maddeleri kullanmaktır.

dPCR'nin Avantajları
1.Mutlak ölçüm elde etme
2.Daha yüksek hassasiyet ve özgüllük
3.Düşük kopya örneklerini algılayabilir
dPCR'nin dezavantajları1. Pahalı ekipman ve reaktifler 2. Karmaşık işlem ve uzun tespit süresi 3. Dar tespit aralığı

Şu anda PCR teknolojisinin üç neslinin kendine göre avantajları ve dezavantajları var ve her birinin kendi uygulama alanları var ve bir neslin diğerinin yerini alması gibi bir ilişki söz konusu değil.Teknolojinin sürekli ilerlemesi, PCR teknolojisine yeni bir canlılık katarak, onun bir uygulama yönünü birbiri ardına açmasını sağlayarak nükleik asit tespitini daha rahat ve doğru hale getirdi.
Kaynak: Dr. Yuan sizi teste götürüyor
 
Önerilen Ürünler:


Gönderim zamanı: Kasım-18-2022