RT-qPCR, moleküler biyolojinin temel deneyidir ve herkesin buna aşina olması gerekir.Esas olarak üç adımı içerir: RNA ekstraksiyonu, cDNA'ya ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR.Yardım etmiyor, neler oluyor?büyük ihtimal sorun vardırters transkripsiyon deneyi!Ters transkripsiyon deneyinin yalnızca RNA, dNTP, primerler veters transkriptazsantrifüj tüpüne koyun ve iyice karıştırın, ancak asıl çalışma sürecinde hala dikkat edilmesi gereken birçok ayrıntı var.Hadi öğrenelim!

RNA'nın kalitesi nasıl belirlenir?
cDNA elde etmek için RNA'nın kalitesi çok önemlidir!RNA kalitesi esas olarak iki yönden tespit edilebilir:
(1) RNA bütünlüğü:RNA bütünlüğü, agaroz jel elektroforezi ile doğrulanabilir. Ökaryotları örnek olarak alırsak, tam toplam RNA'nın üç açık bandı vardır, büyükten küçüğe moleküler ağırlıklar 28S, 18S ve 5S'dir ve 28S, 18S'den iki kat daha parlaktır;üç bant görülebiliyorsa, ancak bant tipi bulanıksa veya Difüzyon, RNA'nın kısmen bozulduğu anlamına gelir.Şu anda, lütfen hemen ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin ve şablon girişini uygun şekilde artırın;sadece küçük moleküler ağırlığa sahip bir bant görülebiliyorsa veya hiç bant görülemiyorsa, RNA tamamen bozulmuştur ve yeniden ekstrakte edilmesi gerekir.Agilent 2100, zirve diyagramı ve RIN değeri ile RNA'nın bütünlüğünü gösterir.Nükleik asit bozulmamışsa, elektroferogramın taban çizgisi düzdür;nükleik asit ciddi şekilde bozunursa, taban çizgisi düzensizdir ve daha fazla bozunma tepe noktası görünür;RIN değeri, 0-10 aralığında RNA'nın bütünlüğünü yansıtır, değer ne kadar büyük olursa, RNA'nın kalitesi o kadar iyi olur.Tamlık derecesi ne kadar yüksek olursa.
(2) RNA'nın Saflığı:OD260/280 oranı UV spektrofotometri ile tespit edilebilir.OD260/280 oranı 1,9 ile 2,1 arasında ise saflık çok iyidir.
Kalıntı genomik DNA, hatalı kantitatif sonuçlara yol açabilir
RNA ekstrakte edildiğinde, elde ettiğimiz RNA temizlenmemiş genomik DNA (gDNA) ile karışabilir.Bu nedenle, ters transkripsiyondan sonra cDNA da karıştırılacaktır.gDNA.Aşağı akış sırasındaqPCRreaksiyon,cDNAve gDNA aynı anda amplifiye edilerek nispeten küçük bir CT değeri elde edilebilir, dolayısıyla sonuçlar yanlı olabilir.
Peki bu durumda ne yapmalıyız?foregeneöneriyor:
(1) RNA ekstraksiyonu sırasında kolon ekstraksiyonu ile çıkarılabilen ters RNA üzerinde genom temizliği gerçekleştirin;
(2) Ekstre edilen RNA'yı DNase ile işleme tabi tutunI , ancak EDTA ile sonlandırın;
ters transkripsiyon reaktifleriningenom temizleme modülleri ile;

Ters transkripsiyon için primerler nasıl seçilir?
Ters transkripsiyon primerleri ayrıca ters transkripsiyon reaksiyonunun sonucunu da etkiler.Deneyin özel koşullarına göre ters transkripsiyon için rastgele primerler, Oligo dT veya gene özel primerler seçebilirsiniz:
(1) Spesifik transkriptler: gene özgü primerler önerilir;
(2) Uzun fragman transkriptleri: Oligo dT/gene özgü primerler önerilir;
(3) Uzun segmentli transkriptlerin dahili fragmanları: gene özgü primerler/ rastgele primerler / rastgele primerler + Oligo dT.Sonraki qPCR deneyi gerçekleştirilirse, Oligo dT tek başına kullanılamaz, çünkü Oligo dT'nin tek başına kullanılması 3' uçlu yanlılığa neden olabilir ve bu da yanlış qPCR deney sonuçlarına yol açar;
(4) miRNA: Stem-loop primerleri veya tailing primerleri kullanılabilir.

Ters transkripsiyon ürünü cDNA niceleme için kaç kez seyreltilmelidir?
Ters transkripsiyon ürününün cDNA'sı elde edildikten sonra, qPCR deneyleri için cDNA'nın kaç kez seyreltilmesi gerektiği çok önemlidir.cDNA konsantrasyonu çok yüksek veya çok düşükse amplifikasyon verimliliği etkilenebilir.cDNA konsantrasyonu ölçülebilir mi ve nasıl yapılmalıdır?
(1) Ters transkripsiyon ürününün cDNA konsantrasyonu ölçülemez çünkü cDNA ürününe ek olarak, ters transkripsiyon ürünü ayrıca ters transkripsiyon kalıntı Tamponu, ters transkriptaz, primerler vb. içerir;Bu sırada bazı arkadaşlar diyecek ki, o zaman arınma sonrası konsantrasyonu ölçeceğim;Burada Foregene, cDNA'nın saflaştırılmasının tavsiye edilmediğini, çünkü tersine çevirme ile elde edilen cDNA'nın uzunluğunun farklı olduğunu ve kısa cDNA'nın saflaştırmada kaybolacağını hatırlatmak ister.
(2) Peki ne yapmalı?qPCR deneyinden önce, cDNA'nın seyreltme gradyanı ön deney yoluyla belirlenebilir.Örneğin: qPCR deneyleri için şablon olarak cDNA stok solüsyonu, 10 kat seyreltme ve 100 kat seyreltme kullanın ve CT değeri 18-28 aralığında olan seyreltme faktörünü seçin.

MiRNA'lar nasıl ters kopyalanmalıdır?
miRNA, protein kodlamayan, yaklaşık 22 nt boyutunda tek sarmallı küçük moleküllü bir RNA'dır.Kısa uzunluğu nedeniyle, geleneksel qPCR yönteminin doğrudan miktarını belirlemek zordur, bu nedenle genellikle miRNA'yı genişletmek gerekir;miRNA için yaygın olarak kullanılan ters transkripsiyon yöntemleri arasında kök döngü yöntemi ve kuyruklama yöntemi bulunur.
Kök döngü yöntemi, kök döngü primerleri ekleyerek miRNA'yı genişletmektir.Bu algılama yöntemi daha yüksek hassasiyete ve özgüllüğe sahiptir, ancak algılama verimi düşüktür.Bir ters transkripsiyon, yalnızca bir miRNA'yı ve bir dahili referansı saptayabilir;kuyruk ekleme yöntemi, PolyA polimeraz ve ters transkriptaz olan iki enzimin ortak çalışmasıyla tamamlanır.PolyA polimeraz, uzunluğunu artırmak için miRNA'ya PolyA kuyrukları eklemekten sorumludur ve ters transkriptaz, ters transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirir.Bu yöntem, yüksek algılama verimine sahiptir ve tek bir ters transkripsiyonda birden çok miRNA'yı ve dahili referansı algılayabilir, ancak kök döngü yönteminde duyarlılık ve özgüllük düşüktür.