• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

PCR, çoklu PCR, Yerinde PCR, Ters PCR, RT-PCR, qPCR(1)PCR

Çeşitli PCR'nin kavramlarını, adımlarını ve ayrıntılarını sıralayacağız

. PCR

PCR olarak adlandırılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu, spesifik DNA fragmanlarını büyütmek için kullanılan moleküler bir biyolojik teknolojidir.İn vitro özel bir DNA replikasyonu olarak kabul edilebilir.DNA polimeraz (DNA Polimeraz I) 1955 gibi erken bir tarihte keşfedildi ve E. Coli'nin deneysel değeri ve pratikliği olan Klenow Fragmenti, 1970'lerin başında Dr. H. Klenow tarafından keşfedildi, ancak bu enzim sıcaklığa tolerans göstermediği için, yüksek sıcaklık onu dejenere edebilir, bu nedenle yüksek sıcaklık dejenerasyonu ile polimeraz zincir reaksiyonunu karşılamaz.Günümüzde kullanılan enzimler (Taq polimeraz olarak adlandırılır), 1976 yılında bir kaplıca bakterisi olan Thermus Aquacus'tan izole edilmiştir. Özelliği yüksek sıcaklığa dayanabilmesi ve ideal bir enzim olmasıdır, ancak 1980'lerden sonra yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır.PCR'nin orijinal ilkel prototipinin orijinal konsepti, 1971'de Dr. KJell Kleppe tarafından önerilen gen onarımı ve kopyalamasına benzer. İlk basit ve kısa süreli gen kopyasını yayınladı (PCR'nin ilk iki döngü reaksiyonuna benzer).Bugün geliştirilen PCR, 1983 yılında Dr. Kary B. Mullis tarafından geliştirilmiştir. Dr. Mullis, o yıl PE şirketlerine hizmet vermiştir, dolayısıyla PE, PCR endüstrisinde özel bir statüye sahiptir.Dr. Mullis, 1985 yılında Saiki ve diğerleriyle birlikte ilk ilgili makaleyi resmi olarak yayınladı. O zamandan beri, PCR kullanımı günde binlerce mildir ve ilgili makalelerin kalitesinin diğer birçok araştırma yöntemini tatsız hale getirdiği söylenebilir.Akabinde PCR teknolojisi, biyolojik bilimsel araştırmalarda ve klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmış ve moleküler biyoloji araştırmalarının en önemli teknolojisi haline gelmiştir.Mullis ayrıca 1993 Nobel Kimya Ödülü'nü kazandı.

PCR1

PCRPrensip

PCR teknolojisinin temel ilkesi, DNA'nın doğal replikasyon sürecine benzer ve özgüllüğü, hedef dizinin her iki ucunu da tamamlayan oligonükleotid primerine bağlıdır.PCR, dejenerasyon-tavlama-uzatma üç temel reaksiyon adımından oluşur: ①Şablon DNA'nın dejenerasyonu: Kalıp DNA belirli bir süre için yaklaşık 93°C'ye ısıtıldıktan sonra, kalıp DNA'nın PCR amplifikasyonu tarafından oluşturulan çift zincirli DNA için ikili DNA Çözeltisi Ayrılıyor, onu tek bir zincir haline getiriyor, böylece bir sonraki tur reaksiyona hazırlanmak için primer ile birleştirilebiliyor.②Şablon DNA ve primerin tavlanması (bileşik): Kalıp DNA ısıtıldıktan ve tek bir zincir halinde dejenere edildikten sonra, sıcaklık yaklaşık 55°C'ye düşer.Primerin tamamlayıcı sekansı ve şablon DNA tek zincirli.③Primerin uzantısı: DNA şablonu-primer bağlanması, reaksiyon ham maddesi olarak dNTP ile TaqDNA polimerazın etkisine dayanır.Çoğaltma ilkesini koruyun, şablon DNA zincirini tamamlayan yeni bir yarı ayrılmış kopya zinciri sentezleyin ve dejenerasyon-tavlama-uzatma döngüsünü tekrarlayın, üç işlem daha fazla "yarı ayrılmış kopya zinciri" elde edebilir ve bu yeni zincir tekrar kullanılabilir Bir sonraki döngü için bir şablon olun.Döngüyü tamamlamak 2-4 dakika sürer, hedef gen 2-3 saat içinde birkaç milyon kez çoğaltılabilir.

StandartPCRReaksiyon Sistemi

Taq DNA Polimeraz

2,5 ul

Mg2+

1,5 mmol/L

10× amplifikasyon tamponu

10ul

4 dNTP karışımı

200ul

Şablon DNA'sı

0.1~2μg

Astar

10~100μl

Çift veya üçlü buharlama suyu ekleyin

100 ul

PCR reaksiyonunun beş unsuru

PCR reaksiyonunda esas olarak primer, enzim, dNTP, şablon ve tampon (Mg2+ gereklidir) olmak üzere beş çeşit madde vardır.[PCR prosedürü]

Standart PCR işlemi üç adıma ayrılmıştır

1. DNA dejenerasyonu (90°C-96°C): Termal etki altındaki çift zincirli DNA şablonları, hidrojen bağları kırılarak tek zincirli bir DNA oluşturur.

2. Tavlama (25°C -65°C): Sistem sıcaklığı düşürülür, primer, yerel bir çift zincir oluşturmak için DNA şablonuyla birleştirilir.

3. Uzatma (70°C -75°C): Taq enziminin etkisi altında (yaklaşık 72°C, en iyi aktivite), dNTP hammadde olarak kullanılır, primerin 5' ucundan → 3' ucuna kadar uzanır, sentez ve şablon DNA zincirini tamamlar.

Her döngü, DNA içeriğini ikiye katlayarak denatüre edilir, tavlanır ve uzatılır.Şu anda, kısa amplifikasyon alanı nedeniyle, Taq enzim aktivitesi optimal olmasa bile bazı PCR'ler çok kısa sürede kopyalanabilir, bu nedenle iki adıma değiştirilebilir, yani tavlama ve uzatma aynı anda 60°C-65°C'de gerçekleştirilebilir.Kaldırma ve soğutma sürecini azaltmak ve tepki hızını artırmak için.

PCR Reaksiyonu özellikleri

● Yüksek Özgüllük

PCR yanıtının spesifik belirleyici faktörleri şunlardır: ①Primer ve şablon DNA'nın spesifik kombinasyonu.②Baz eşleştirme ilkesi.③TaqDNA polimeraz sentez reaksiyonunun sadakati.④Hedef genin özgüllüğü ve tutuculuğu.

Primerlerin ve şablonların doğru kombinasyonu anahtardır.Primer ve şablonun bağlanması ve primer zincirinin uzaması, alkalin baz uyumu ilkesine dayanır.Polimeraz sentez reaksiyonlarının sadakati ve Taq DNA polimerazın reaksiyondaki şablon ve primerin bağlanmasını (bileşik) yapma konusundaki yüksek sıcaklık direnci, daha yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilebilir.Kombinasyonun özgüllüğü büyük ölçüde artar.Klips, yüksek derecede doğruluk sağlayabilir.Yüksek konservatif ve yüksek muhafazakarlığa sahip bir hedef genetik bölge seçilerek, özgüllüğü daha yüksektir.

● Yüksek Hassasiyet

PCR ürünlerinin üretim hacmi, mikrodenetleyici düzeyini mikrogram düzeyine (μg= -6) yükseltmek için Picker'ın başlangıç ​​şablonunu (PG=10-12) genişletebilen indekse göre artırılır.1 milyon hücreden bir hedef hücre tespit edilebilir;virüslerin saptanmasında, PCR'nin duyarlılığı 3 RFU'ya ulaşabilir (boş noktalar oluşturulmuş birimler);bakteri biliminde minimum saptama oranı 3 bakteridir.

● Basit ve Hızlı

PCR yansıması, reaksiyon solüsyonunu bir kerede ekleyen, yani DNA amplifikasyon solüsyonu ve su banyosu kabına bir dejenerasyon-tavlama-uzatma reaksiyonu ekleyen yüksek sıcaklıkta bir Taq DNA polimeraz kullanır.Genellikle amplifikasyon reaksiyonu 2 ila 4 saatte tamamlanır.Artırılmış ürünler genellikle elektrikli kılıçla analiz edilir ve izotop kullanmak zorunda değildir, radyoaktif kirlilik yoktur ve kolay tanıtım yapılır.

● Numunenin saflığı düşük

Virüsleri veya bakterileri ve kültür hücrelerini ayırmaya gerek yoktur.DNA ham ürünleri ve RNA, amplifikatörler olarak kullanılabilir.DNA amplifikasyon tespiti, kan, vücut sıvısı, öksürük yıkama sıvısı, saç, hücreler ve canlı doku gibi klinik örnekler kullanılarak doğrudan kullanılabilir.

PCRortak sorunlar

● Yanlış negatif, yükseltilmiş bant yok

PCR reaksiyonunun temel aşamaları şunları içerir: ① şablon nükleik asitlerin hazırlanması, ② primerlerin kalitesi ve özgüllüğü, ③ enzimlerin kalitesi ④ PCR döngü koşulları.Sebebi bulmak, yukarıdaki bağlantılar için de analiz edilmeli ve çalışılmalıdır.

Şablonlar: ① Şablon çeşitli protein içerir, ② Şablon bir Taq enzim inhibitörü içerir, ③ Şablondaki protein, özellikle kromozomdaki grup proteini elimine edilmez.⑤ Mayın temizleyici nükleik asit dejenerasyonu tam değildir.Enzimlerin ve primerlerin kalitesi iyi olduğunda, büyük olasılıkla numunelerin sindirim işlemi olan amplifikasyon bandı yoktur.Şablon nükleik asit ekstraksiyon işleminde bir sorun var, bu nedenle etkili ve kararlı bir sindirim solüsyonu hazırlamak için prosedürü sabitlenmeli ve keyfi olarak değiştirilmemelidir.

Enzim inaktivasyonu: Yeni bir enzim veya eski ve yeni enzimlerin birlikte kullanılması, enzim aktivitesinin kaybolup kaybolmadığını veya yetersiz olup olmadığını analiz etmek için yanlış negatiflere yol açmalıdır.Taq enzimi veya etidyum bromürün bazen unutulduğuna dikkat edilmelidir.

Primer: Primerin kalitesi, primerin konsantrasyonu ve iki primerin konsantrasyonunun simetrik olup olmadığı.PCR başarısızlığının yaygın bir nedenidir veya artan bant ideal değildir ve yayılmaya eğilimlidir.Bazı parti numaralarının astarlarının kalitesiyle ilgili sorunlar var.İki primer yüksek konsantrasyona ve düşük konsantrasyona sahiptir ve düşük verimli asimetrik amplifikasyona neden olur.Karşı önlemler şunlardır: ① Birimleri sentezlemek için iyi bir primer seçin.② Primer konsantrasyonu sadece OD değerine bağlı değildir, aynı zamanda agar şeker jeli elektroforezi yapmak için primerin orijinal sıvısına da dikkat eder.Bir primer şerit bölgesi olmalı ve iki primerin parlaklığı genel olarak tutarlı olmalıdır.Belt, PCR bu sefer başarısız olabilir ve primer sentez ünitesi ile çözülmesi gerekir.Bir astar yüksekse, parlaklık düşüktür ve seyreltildiğinde konsantrasyonu dengelenmelidir.③ Astarın bozulmasına ve bozulmasına neden olacak şekilde, buzdolabının birden fazla donmasını veya uzun süreli soğutma parçalarını önlemek için astar ödenmeli ve yüksek konsantrasyonda saklanmalıdır.④ Primer uzunluğunun yetersiz olması ve primerler arasında di kümesi oluşması gibi primer tasarımı mantıksızdır.

Mg2+konsantrasyon: Mg2+iyon konsantrasyonunun PCR amplifikasyon verimliliği üzerinde büyük etkisi vardır.Aşırı konsantrasyon, PCR amplifikasyonunun karşı cinsi azaltabilir.Konsantrasyon çok düşükse, PCR amplifikasyon çıkışı, genişleme bandı olmadan PCR amplifikasyonunun başarısız olmasına bile neden olur.

Reaksiyon hacminin değiştirilmesi: PCR amplifikasyonunda kullanılan hacim 20ul, 30ul ve 50ul veya 100uL'dir, PCR amplifikasyonu için uygulamanın büyük hacmi, farklı bilimsel araştırma ve klinik test amaçlarına göre ayarlanır.20ul gibi küçük hacimler yaptıktan sonra ölçüyü yaparken ip durumu yapmak gerekiyor aksi takdirde başarısız olur.

Fiziksel nedenler: PCR amplifikasyonu için transformasyon çok önemlidir.Dejenerasyon sıcaklığı düşükse, dejenerasyon süresi kısadır, yanlış negatiflerde meydana gelme olasılığı yüksektir;çok düşük tavlama sıcaklığı spesifik olmayan amplifikasyona neden olabilir ve spesifik amplifikasyon verimliliğini azaltabilir.PCR amplifikasyon verimliliğini azaltmak için primerler ve şablonların kombinasyonunu yüksek oranda etkiler.Bazen PCR'nin başarısız olmasının nedenlerinden biri olan uzatma veya suda çözünür ocaktaki değişkenliği, tavlamayı ve uzamış sıcaklığı tespit etmek için standart termometrelerin kullanılması gerekir.

Hedef sekans varyantları: Hedef sekans meydana gelirse, bir mutasyon veya delesyon, prototip ve şablonun kombinasyonu birleştirilirse veya bir hedef sekansın olmaması nedeniyle, primer ve şablon tamamlayıcı sekansı kaybeder ve PCR amplifikasyonu başarılı olmaz.

● Yanlış pozitif

PCR amplifikasyon bandı, hedef sekans bandı ile tutarlı görünür ve bazen bandı daha düzgün ve daha yüksektir.

Primer tasarımı uygun değildir: seçilen amplifikasyon sekansı ve amaçsız amplifikasyon sekansı homologdur, dolayısıyla PCR amplifikasyonu yapıldığında, amplifiye PCR ürünleri amaçlı olmayan sekanslardır.Hedef sekans çok kısa veya primer çok kısa ve yanlış pozitif eğilimli.Yeniden tasarlanması gerekiyor.

Hedef dizinin veya amplifikasyon ürünlerinin çapraz kirlenmesi: Bu kirliliğin iki nedeni vardır: Birincisi, yanlış pozitiflere yol açan tüm genomun veya büyük bölümlerin çapraz kirlenmesi.Bu tür yanlış pozitif, aşağıdaki yöntemlerle çözülebilir: Hedef sekansın numune tabancasına solunmasını veya santrifüj tüpünden sıçramasını önlemek için çalışma sırasında dikkatli ve nazik olun.Yüksek sıcaklıklara dayanamayan enzimler ve maddeler dışında tüm reaktifler veya ekipmanlar yüksek basınçla dezenfekte edilmelidir.Santrifüj boruları ve numuneler tek seferde kullanılmalıdır.Gerektiğinde, numuneler eklenmeden önce, reaksiyon tüpü ve reaktif, mevcut nükleik asidi yok etmek için ultraviyole ışınlarına maruz bırakılır.İkincisi, hava kirliliğindeki küçük parçalar.Bu küçük fragmanlar, hedef sekanstan daha kısadır, ancak belli bir homolojiye sahiptirler.Birbirine eklenebilir.Primerleri tamamladıktan sonra PCR ürünü genişletilebilir, bu da yanlış pozitif üretime neden olur.Nest PCR yöntemini azaltmak veya ortadan kaldırmak için kullanılabilir.

● Spesifik olmayan amplifikasyon bandı görünür

PCR amplifikasyonundan sonra ortaya çıkan bantlar, beklenen boyut veya büyük veya küçük veya aynı zamanda veya aynı zamanda spesifik amplifikasyon bantları ve spesifik olmayan amplifikasyon bantları ile tutarsızdır.Spesifik olmayan bantların ortaya çıkışı: İlk olarak, primerler, hedef diziye eksik tamamlayıcıdır veya bir di küme oluşturmak için primerin polimerizasyonudur.İkincisi, MG2+ iyonlarının konsantrasyonunun çok yüksek olması, tavlama sıcaklığının çok düşük olması ve PCR döngülerinin sayısının ilişkili olmasıdır.İkincisi, enzimlerin kalitesi ve miktarı.Çoğu zaman, bazı kaynakların enzimleri özel olmayan bantlara eğilimlidir ve diğer kaynağın enzimleri oluşmaz.Bazen enzimlerin spesifik olmayan amplifikasyonu da meydana gelir.Karşı önlemler şunlardır: gerekirse yeniden tasarlanmış çekiciler.Enzim miktarını azaltın veya başka bir kaynağın enzimini değiştirin.Birincil miktarını azaltın, şablon miktarını uygun şekilde artırın ve döngü sayısını azaltın.Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın veya iki sıcaklık noktası yöntemini kullanın (93°C dejenerasyon, tavlama ve yaklaşık 65°C'de uzatma).

PCR2

● Kesintili çekme veya lekeli bant görünümü

PCR amplifikasyonu bazen uygulanmış veya kabuklu veya halı benzeri bir kemer gibi görünmektedir.Bu nedenle enzim miktarının fazla olması veya enzimin kalitesinin düşük olması nedeniyle dNTP konsantrasyonu çok yüksek, Mg2+ konsantrasyonu çok yüksek, tavlama sıcaklığı çok düşük ve döngü sayısı çok fazladır.Karşı önlemler şunlardır: ①Enzim miktarını azaltın veya başka bir kaynağın enzimini değiştirin.②dNTP konsantrasyonunu azaltın ③Mg2+ konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın.④Şablon miktarını artırın ve döngü sayısını azaltın.

ilgili ürünler

PCR3

PCR Heroᵀᴹ (Boya ile)

◮ Daha yüksek doğruluk: Sıradan Taq enziminin 6 katı;

◮ Daha hızlı amplifikasyon hızı

◮ Daha fazla şablon uyarlanabilirliği

◮ Daha yüksek amplifikasyon verimliliği

◮ Çevresel tolerans daha güçlüdür: bir hafta boyunca 37°C'de tutulur, %90'dan fazla aktivite korunur;

◮ 5'→3' DNA polimeraz aktivitesine ve 5'→3' ekzonükleaz aktivitesine sahiptir, 3'→5' ekzonükleaz aktivitesi yoktur.

PCR4

PCR Easyᵀᴹ (Boya ile)

Eşsiz reaksiyon sistemi ve yüksek verimliliğe sahip Taq DNA Polimeraz, PCR reaksiyonunun daha yüksek amplifikasyon verimliliğine, özgüllüğüne ve duyarlılığına sahip olmasını sağlar.

PCR5

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Tek Adım)-SYBR Yeşil I

◮ Tek adımlı kit, aynı tüpte ters transkripsiyon ve qPCR iki reaksiyon yapar, yalnızca şablon RNA, spesifik PCR primerleri ve RNaz İçermeyen ddH eklenmesi gerekir2O.

◮ Kit, viral RNA'yı veya iz RNA'yı hızlı ve verimli bir şekilde kantitatif olarak analiz edebilir.

◮ Kit, reaksiyonun amplifikasyon verimliliğini ve özgüllüğünü etkili bir şekilde iyileştirmek için benzersiz bir Foregene ters transkripsiyon reaktifi ve benzersiz bir reaksiyon sistemiyle birleştirilmiş Foregene HotStar Taq DNA Polimeraz kullanır.

◮ Optimize edilmiş reaksiyon sistemi, reaksiyonun daha yüksek algılama hassasiyetine, daha güçlü termal kararlılığa ve daha iyi toleransa sahip olmasını sağlar.

◮ RT-qPCR KolayTM(Tek Adım)-SYBR Green I kiti, kuyucuklar arasındaki sinyal arka planını ve sinyal hatalarını ortadan kaldırmak için kullanılabilen ve müşterilerin farklı kantitatif PCR cihazları modellerinde kullanması için uygun olan ROX dahili referans boyası ile birlikte gelir.

PCR6

RT KolayTMIII (Ana Premiks için için birinci sarmal cDNA senteziGerçek Zamanlı PCR)

-Şablondaki gDNA'yı 2 dakika içinde kaldırabilen gDNA'yı etkili bir şekilde kaldırma yeteneği.

-Verimli ters transkripsiyon sistemi, ilk sarmal cDNA'nın sentezini tamamlamak yalnızca 15 dakika sürer.

-Karmaşık şablonlar: Yüksek GC içeriğine ve karmaşık ikincil yapıya sahip şablonlar da yüksek verimlilikle tersine çevrilebilir.

-Yüksek hassasiyetli ters transkripsiyon sistemi, pg düzeyinde şablonlar da yüksek kaliteli cDNA alabilir.

-Ters transkripsiyon sistemi yüksek termal stabiliteye sahiptir, optimum reaksiyon sıcaklığı 42 ℃'dir ve 50 ℃'de hala iyi ters transkripsiyon performansına sahiptir.


Gönderim zamanı: 18 Mart-2023