COVID-19, Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs Tip 2'nin neden olduğu bulaşıcı bir hastalıktır. Bir kişi enfekte olduğunda en yaygın semptomlar ateş, öksürük ve nefes darlığıdır.
Test için kullanılan numuneler, nazofaringeal sürüntülerle veya orofaringeal sürüntülerle toplanabilir.
Standart koronavirüs tespiti yöntemi, polimeraz zincir reaksiyonu, PCR'dir.Bu, moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.Milyonlarca ila milyarlarca spesifik DNA parçasını hızlı bir şekilde kopyalayabilir.
Yeni koronavirüs, çok uzun tek sarmallı bir RNA genomu içerir.Bu virüsleri PCR ile saptamak için, RNA moleküllerinin ters transkriptaz ile tamamlayıcı DNA dizilerine dönüştürülmesi gerekir ve ardından yeni sentezlenen DNA, yaygın olarak RT-PCR olarak bilinen standart PCR prosedürleriyle çoğaltılabilir.
RT-PCR işlemi
RNA ekstraksiyonu
Bu yöntemi gerçekleştirmek için temel olarak viral RNA'nın ekstrakte edilmesi gerekir.Uygun, hızlı ve etkili ayırma için çeşitli RNA saflaştırma kitleri kullanılabilir.
Ticari bir kit kullanarak viral RNA'yı çıkarmak için önce örneği bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve ardından lizis tamponu ile karıştırın.Bu tampon oldukça denatüredir ve genellikle fenol ve guanidin izotiyosiyanattan oluşur.Ek olarak, bozulmamış viral RNA'nın izolasyonunu sağlamak için lizis tamponunda genellikle RNaz inhibitörleri bulunur.
Lizis tamponunu ekledikten sonra, karıştırma tüpünü darbe ile vorteksleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin.Virüs daha sonra lizis tamponu tarafından sağlanan oldukça denatüre edici koşullar altında lize edilir.
Numune parçalandıktan sonra saflaştırma prosedürü için bir santrifüj tüpü kullanılır.Numune santrifüj tüpüne yüklenir ve ardından santrifüjlenir.
Bu prosedür, durağan fazın bir silika jel matrisinden oluştuğu bir katı faz ekstraksiyon yöntemidir.
Optimal tuz ve pH koşulları altında, RNA molekülleri silika zarına bağlanır.
Aynı zamanda protein ve diğer kirleticiler de uzaklaştırılır.
Santrifüjlemeden sonra santrifüj tüpünü temiz bir toplama tüpüne koyun, süzüntüyü atın ve ardından yıkama tamponu ekleyin.
Yıkama tamponunu membrandan zorlamak için tüpü tekrar santrifüje yerleştirin.Bu, zardan kalan tüm safsızlıkları giderecek ve yalnızca silika jele bağlı RNA'yı bırakacaktır.
Numune yıkandıktan sonra tüpü temiz bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve elüsyon tamponunu ekleyin.
Daha sonra, elüsyon tamponunu zar boyunca zorlamak için santrifüjlenir.Elüsyon tamponu, viral RNA'yı döndürme kolonundan uzaklaştırır ve proteinler, inhibitörler ve diğer kontaminantlardan arınmış saflaştırılmış RNA elde eder.
Karışık konsantre
Viral RNA'nın ekstrakte edilmesinden sonraki adım, reaksiyon karışımının PCR amplifikasyonu için hazırlanmasıdır.Bu adımda konsantre kullanılır.Bu konsantre çözelti, bir ön karışım, ters transkriptaz, nükleotidler, ileri primer, ters primer, TaqMan probu ve DNA polimerazdan oluşan önceden karıştırılmış konsantre bir solüsyondur.
Son olarak, bu reaksiyon karışımını tamamlamak için RNA şablonu eklenir.Tüpler, darbeli vorteksleme ile karıştırılır ve daha sonra reaksiyon karışımı, PCR plakasına yüklenir.PCR plakası genellikle 96 kuyu içerir ve aynı anda birden fazla numuneyi analiz edebilir.
PCR amplifikasyonu
Daha sonra, plakayı esas olarak bir termal döngüleyici olan PCR makinesine yerleştirin.
Gerçek zamanlı RT-PCR, RdrRP geni, E geni ve N genindeki hedef diziyi güçlendirerek 2019 yeni koronavirüsü saptamak için kullanılır.Hedef genin seçimi, primer ve prob dizisine bağlıdır.
RT-PCR'nin ilk adımı ters transkripsiyondur.Viral RNA genomunun tamamlayıcı kısmına bağlanan PCR ters primeri tarafından başlatılan tamamlayıcı DNA'nın ilk ipliği sentezlenir.Daha sonra ters transkriptaz, viral RNA'ya tamamlayıcı DNA'yı sentezlemek için primerin 3' ucuna DNA nükleotidleri ekler.Bu adımın sıcaklığı ve süresi kullanılan primerlere, hedef RNA'ya ve ters transkriptazlara bağlıdır.
Daha sonra, RNA-DNA hibritinin denatürasyonuyla sonuçlanan bir ilk denatürasyon adımı uygulanır.Bu adım, DNA polimerazı aktive etmek için gereklidir.Aynı zamanda, ters transkriptaz inaktive edilir.
PCR bir dizi termal döngüden oluşur.Her döngü denatürasyon, tavlama ve uzatma adımlarından oluşur.
Denatürasyon adımı, reaksiyon odasının 95 santigrat dereceye ısıtılmasını ve bunun çift sarmallı DNA şablonunun denatürasyonu için kullanılmasını içerir.
Bir sonraki adımda, reaksiyon sıcaklığı 58 santigrat dereceye düşürülür ve ileri primerin tek sarmallı DNA şablonunun tamamlayıcı kısmına tavlanmasına izin verilir.Tavlama sıcaklığı doğrudan astarın uzunluğuna ve bileşimine bağlıdır.
Uzatma adımında, DNA polimeraz, DNA şablon sarmalına tamamlayıcı olan yeni bir DNA sarmalını sentezler.Reaksiyon karışımından 5'ila 3'yönünde kalıba tamamlayıcı serbest çekirdekler ekleyerek.Bu adımın sıcaklığı, kullanılan DNA polimeraza bağlıdır.
İlk döngüden sonra, çift sarmallı bir DNA hedefi elde edilir.
Ardından, ikinci döngüye girin.Çift sarmallı DNA, iki tek sarmallı DNA molekülü üretmek için denatüre edilir.
Bir sonraki adımda, reaksiyon sıcaklığı düşürülür, primerler her bir tek sarmallı DNA şablonuna tavlanır ve Taq-man probu, hedef DNA'nın tamamlayıcı kısmına tavlanır.
TaqMan probu, oligonükleotit probunun 5' ucuna kovalent olarak bağlı bir florofordan oluşur.Döngüleyicinin ışık kaynağı tarafından uyarıldığında, flüorofor flüoresans yayar.Ek olarak, prob 3' ucunda bir söndürücüden oluşur.Raportör genin söndürücüye yakınlığı floresansın tespit edilmesini engeller.
Uzatma adımında, DNA polimeraz yeni bir zincir sentezler.Polimeraz TaqMan probuna ulaştığında, endojen 5'nükleaz aktivitesi, boyayı söndürücüden ayırarak probu ayırır.
Her PCR döngüsünde daha fazla boya molekülü salınır ve bu da sentezlenen amplikonların sayısıyla orantılı olarak floresan yoğunluğunda bir artışa neden olur.
Bu yöntem, numunede bulunan belirli bir dizinin sayısını tahmin etmeye izin verir.Çift sarmallı DNA fragmanlarının sayısı her döngüde iki katına çıkar.Bu nedenle, PCR çok küçük numuneleri analiz etmek için kullanılabilir.
Floresan sinyalini ölçmek için, tungsten halojen lamba, uyarma filtresi, reflektör, lens, emisyon filtresi ve şarj bağlantılı cihaz kullanımlı CCD kamera.
ADIM 4 Tespit
Floresan sinyalini ölçmek için, tungsten halojen lamba, uyarma filtresi, reflektör, lens, emisyon filtresi ve şarj bağlantılı cihaz kullanımlı CCD kamera.
Lambadan gelen filtrelenmiş ışık reflektör tarafından yansıtılır, yoğunlaştırıcı merceğin içinden geçer ve her bir deliğin merkezine odaklanır.Daha sonra delikten yayılan floresan aynadan yansıtılır, emisyon filtresinden geçer ve CCD kamera tarafından algılanır.Her PCR döngüsünde, kendi kendine uyarılan florofor ışığı CCD tarafından saptanabilir.
Yakalanan ışığı dijital verilere dönüştürür.Bu yönteme gerçek zamanlı PCR denir ve PCR reaksiyonunun ilerlemesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.
Gönderim zamanı: 19 Temmuz 2021