RT-qPCR, sıradan PCR teknolojisinden geliştirilmiştir.Geleneksel PCR reaksiyon sistemine floresan kimyasallar (floresan boyalar veya floresan problar) ekler ve farklı lüminesans mekanizmalarına göre PCR tavlama ve uzatma sürecini gerçek zamanlı olarak tespit eder.Ortamdaki floresan sinyal değişiklikleri, her bir PCR döngüsündeki ürün değişikliği miktarını hesaplamak için kullanılır.Şu anda en yaygın yöntemler floresan boya yöntemi ve prob yöntemidir.

Floresan boya yöntemi:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, vb. gibi bazı floresan boyalar kendi başlarına ışık yaymazlar, ancak dsDNA'nın küçük oluğuna bağlandıktan sonra floresans yayarlar.Bu nedenle, PCR reaksiyonunun başlangıcında, makine floresan sinyalini algılayamaz.Reaksiyon, tavlama-uzatma (iki aşamalı yöntem) veya uzatma aşamasına (üç aşamalı yöntem) ilerlediğinde, bu sırada çift sarmallar açılır ve yeni DNA polimeraz, sarmal sentezi sırasında, flüoresan moleküller dsDNA minör oluğunda birleştirilir ve flüoresans yayar.PCR döngülerinin sayısı arttıkça, daha fazla boya dsDNA ile birleşir ve flüoresan sinyali de sürekli olarak artar.Örnek olarak SYBR Green Ⅰ'yi alın.
Prob yöntemi:
Taqman probu en yaygın kullanılan hidroliz probu.Probun 5' ucunda genellikle FAM olan bir floresan grup vardır.Probun kendisi, hedef gene tamamlayıcı bir dizidir.Floroforun 3' ucunda bir floresan söndürme grubu vardır.Floresans rezonans enerji transferi (Förster rezonans enerji transferi, FRET) prensibine göre, raportör floresan grup (donör floresan molekül) ve söndürücü floresan grup (alıcı floresan molekül) olduğunda Uyarma spektrumu çakıştığında ve mesafe çok yakın olduğunda (7-10nm), donör molekülün uyarılması, otofloresans zayıflarken alıcı molekülün floresansını indükleyebilir.Bu nedenle, PCR reaksiyonunun başlangıcında, prob sistemde serbest ve bozulmamış olduğunda, raportör floresan grubu floresan yaymayacaktır.Tavlama sırasında primer ve prob şablona bağlanır.Uzatma aşamasında, polimeraz sürekli olarak yeni zincirleri sentezler.DNA polimerazın 5'-3' eksonükleaz aktivitesi vardır.Proba ulaşırken, DNA polimeraz probu şablondan hidrolize edecek, raportör floresan grubunu söndürücü floresan grubundan ayıracak ve floresan sinyalini serbest bırakacaktır.Prob ile şablon arasında bire bir ilişki olduğu için, prob yöntemi, testin doğruluğu ve hassasiyeti açısından boya yöntemine göre üstündür.

Şekil 1 qRT-PCR Prensibi

Astar tasarımı
Prensipler:

Primerler, nükleik asit serisinin korunmuş bölgesinde tasarlanmalı ve özgüllüğe sahip olmalıdır.

cDNA dizisini kullanmak en iyisidir ve mRNA dizisi de kabul edilebilir.Değilse, DNA dizisinin cds bölge tasarımını öğrenin.
Floresan kantitatif ürünün uzunluğu 80-150bp, en uzunu 300bp, primer uzunluğu genellikle 17-25 baz arasındadır ve upstream ve downstream primerler arasındaki fark çok büyük olmamalıdır.

G+C içeriği %40 ile %60 arasındadır ve %45-55 en iyisidir.
TM değeri 58-62 derece arasındadır.
Try to avoid primer dimers and self-dimers, (do not appear more than 4 pairs of consecutive complementary bases) hairpin structure, if unavoidable, make ΔG<4.5kJ/mol* If you cannot ensure that gDNA has been removed during reverse transcription Clean, it is best to design the primers of the intron *3′ end can not be modified, and to avoid AT, GC rich regions, avoid T/C, A/G continuous structure (2-3) primers and non-
Spesifik Heterojen olarak çoğaltılan sekansın homolojisi tercihen %70'ten azdır veya 8 tamamlayıcı baz homolojisine sahiptir.
Veri tabanı:
CottonFGD anahtar kelimelere göre arama
Astar tasarımı:
IDT-qPCR astar tasarımı

Fig2 IDT çevrimiçi primer tasarım aracı sayfası

Şekil3 sonuç sayfası ekranı
lncRNA primerlerinin tasarımı:
lncRNA'sı:mRNA ile aynı adımlar.
miRNA:Kök döngü yönteminin ilkesi: Tüm miRNA'lar yaklaşık 23 nt'lik kısa diziler olduğundan, doğrudan PCR tespiti gerçekleştirilemez, bu nedenle kök döngü dizi aracı kullanılır.Kök ilmek dizisi, kendi başına bir saç tokası yapısı oluşturabilen, yaklaşık 50 nt'lik tek sarmallı bir DNA'dır.3' Uç, miRNA kısmi fragmanını tamamlayıcı bir dizi olarak tasarlanabilir, ardından hedef miRNA, ters transkripsiyon sırasında kök-ilmek dizisine bağlanabilir ve toplam uzunluk, qPCR ile belirlenen amplifiye ürünün uzunluğu ile aynı çizgide olan 70bp'ye ulaşabilir.Kuyruk miRNA primer tasarımı.
Amplifikasyona özgü algılama:
Online patlatma veri tabanı: Sekans benzerliğine göre CottonFGD patlatma
Yerel patlama: Yerel patlama yapmak için Blast+ kullanımına bakın, linux ve macos doğrudan yerel bir veritabanı kurabilir, win10 sistemi de ubuntu bash kurulduktan sonra yapılabilir.Yerel patlatma veri tabanı ve yerel patlatma oluşturun;ubuntu bash'ı win10'da açın.
Dikkat: Yayla pamuğu ve deniz adası pamuğu tetraploid mahsullerdir, bu nedenle patlamanın sonucu genellikle iki veya daha fazla eşleşme olur.Geçmişte, patlama gerçekleştirmek için bir veri tabanı olarak NAU cd'lerini kullanmak, muhtemelen yalnızca birkaç SNP farklılığına sahip iki homolog gen bulacaktır.Genellikle, iki homolog gen, primer tasarımıyla ayrılamaz, dolayısıyla aynı şekilde ele alınırlar.Bariz bir indel varsa, primer genellikle indel üzerinde tasarlanır, ancak bu, primerin ikincil yapısına yol açabilir. Serbest enerji yükselir ve amplifikasyon veriminde bir azalmaya yol açar, ancak bu kaçınılmazdır.

Astar ikincil yapısının tespiti:
Adımlar:oligo 7'yi açın → şablon dizisini girin → alt pencereyi kapatın → kaydedin → şablondaki primeri bulun, primer uzunluğunu ayarlamak için ctrl+D'ye basın → self-dimerizasyon gövdesi, heterodimer, saç tokası, uyumsuzluk vb. gibi çeşitli ikincil yapıları analiz edin. Şekil 4'teki son iki resim primerlerin test sonuçlarıdır.Ön astarın sonucu iyidir, belirgin bir dimer ve saç tokası yapısı yoktur, sürekli tamamlayıcı bazlar yoktur ve serbest enerjinin mutlak değeri 4,5'ten azdır, arka astar ise sürekli gösterir. 6 baz tamamlayıcıdır ve serbest enerji 8,8'dir;ayrıca 3' ucunda daha ciddi bir dimer belirir ve ardışık 4 bazdan oluşan bir dimer belirir.Serbest enerji yüksek olmasa da, 3' dimer Chl, amplifikasyon özgüllüğünü ve amplifikasyon verimliliğini ciddi şekilde etkileyebilir.Ek olarak, saç tokası, heterodimer ve uyumsuzluk olup olmadığını kontrol etmek gerekir.

Şekil 3 oligo7 tespit sonuçları
Amplifikasyon verimliliği tespiti:
PCR reaksiyonunun amplifikasyon verimliliği, PCR sonuçlarını ciddi şekilde etkiler.Ayrıca qRT-PCR'de amplifikasyon verimliliği kantitatif sonuçlar için özellikle önemlidir.Reaksiyon tamponundaki diğer maddeleri, makineleri ve protokolleri çıkarın.Primerlerin kalitesi de qRT-PCR'nin amplifikasyon verimliliği üzerinde büyük bir etkiye sahiptir.Sonuçların doğruluğunu sağlamak için, hem bağıl flüoresan ölçümü hem de mutlak flüoresan ölçümü, primerlerin amplifikasyon etkinliğini tespit etmelidir.Etkili qRT-PCR amplifikasyon verimliliğinin %85 ile %115 arasında olduğu kabul edilmektedir.İki yöntem vardır:
1. Standart eğri yöntemi:
A.cDNA'yı karıştırın
B.gradyan seyreltme
c.qPCR
D.Amplifikasyon verimliliğini hesaplamak için lineer regresyon denklemi
2. LinRegPCR
LinRegPCR, SYBR Green veya benzer kimyaya dayalı kantitatif PCR (qPCR) verileri olarak da adlandırılan gerçek zamanlı RT-PCR Verilerinin analizi için bir programdır.Program, taban çizgisi olmayan düzeltilmiş verileri kullanır, her örnek üzerinde ayrı ayrı bir temel düzeltmesi gerçekleştirir, bir doğrusallık penceresi belirler ve ardından PCR veri seti boyunca düz bir çizgiye sığdırmak için doğrusal regresyon analizi kullanır.Bu çizginin eğiminden her bir numunenin PCR etkinliği hesaplanır.Amplikon başına ortalama PCR verimliliği ve numune başına Ct değeri, rastgele floresan birimlerinde ifade edilen numune başına başlangıç ​​konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır.Veri girişi ve çıkışı bir Excel elektronik tablosu aracılığıyla yapılır.sadece örnek
karıştırma gereklidir, gradyan yok
adımlar gereklidir:(Örnek olarak Bole CFX96'yı alın, net ABI'lı Makine değil)
deney:standart bir qPCR deneyidir.
qPCR veri çıkışı:LinRegPCR iki çıktı dosyası biçimini tanıyabilir: RDML veya kantifikasyon Amplifikasyon sonucu.Aslında, döngü sayısı ve floresan sinyalinin makine tarafından gerçek zamanlı tespit değeridir ve amplifikasyon, lineer segment verimliliğinin floresans değişim değeri analiz edilerek elde edilir.
veri seçimi: Teorik olarak RDML değeri kullanılabilir olmalıdır.Bilgisayarımın sorunu yazılımın RDML'yi tanıyamaması olduğu tahmin ediliyor, bu yüzden orijinal veri olarak excel çıktı değerine sahibim.Numune ekleyememe vb. gibi verilerin önce kabaca taranması önerilir. Çıktı verilerindeki noktalar silinebilir (elbette onları silemezsiniz, LinRegPCR daha sonraki aşamada bu noktaları göz ardı edecektir)

Şekil 5 qPCR veri aktarımı

Aday örneklerin Şekil 6 seçimi

Veri girişi:Nitelik amplifikasyonu sonuçları.xls'yi açın, → LinRegPCR'yi açın → dosyayı açın → excel'den okuyun → parametreleri Şekil 7'de gösterildiği gibi seçin → Tamam → temel çizgileri belirle'ye tıklayın

linRegPCR veri girişinin Şekil7 adımları

Sonuç:Tekrar yoksa gruplamaya gerek yoktur.Tekrar varsa örnek gruplamada gruplandırma düzenlenebilir ve tanımlayıcıya genin adı girilir ve ardından aynı gen otomatik olarak gruplanır.Son olarak, dosyaya tıklayın, excel'i dışa aktarın ve sonuçları görüntüleyin.Her kuyucuğun amplifikasyon verimliliği ve R2 sonuçları görüntülenecektir.İkinci olarak, gruplara ayırırsanız, düzeltilmiş ortalama amplifikasyon verimliliği görüntülenecektir.Her primerin amplifikasyon verimliliğinin %85 ile %115 arasında olduğundan emin olun.Çok büyük veya çok küçükse bu, primerin amplifikasyon etkinliğinin zayıf olduğu anlamına gelir.

Şekil 8 Sonuç ve veri çıkışı

Deneysel süreç:
RNA kalite gereksinimleri:
Saflık:1.72.0 kalıntı izotiyosiyanat olabileceğini gösterir.Temiz nükleik asit A260/A230 2 civarında olmalıdır. 230 nm'de güçlü bir absorpsiyon varsa, bu fenat iyonları gibi organik bileşiklerin olduğunu gösterir.Ayrıca %1,5 agaroz jel elektroforezi ile de tespit edilebilmektedir.İşaretçiyi doğrultun, çünkü ssRNA'nın denatürasyonu yoktur ve moleküler ağırlık logaritmasının doğrusal bir ilişkisi yoktur ve moleküler ağırlık doğru bir şekilde ifade edilemez.Konsantrasyon: Teorik olarakOlumsuz100ng/ul'den az, konsantrasyon çok düşükse, saflık genellikle düşük, uzun değil

Şekil 9 RNA jeli

Ek olarak, numune değerliyse ve RNA konsantrasyonu yüksekse, ekstraksiyondan sonra alikuotlanması ve ters transkripsiyon için RNA'yı 100-300ng/ul nihai konsantrasyona seyreltilmesi önerilir.İçindeters transkripsiyon sürecimRNA kopyalandığında, ters transkripsiyon için spesifik olarak polyA kuyruklarına bağlanabilen oligo (dt) primerleri kullanılırken, lncRNA ve circRNA, toplam RNA'nın ters transkripsiyonu için rastgele hekzamer (Random 6 mer) primerleri kullanır. miRNA için, ters transkripsiyon için miRNA'ya özgü boyun halkası primerleri kullanılır.Birçok şirket artık özel atık kitleri piyasaya sürdü.Stem-loop yöntemi için, kuyruklama yöntemi daha uygundur, yüksek verimlidir ve reaktif tasarrufu sağlar, ancak aynı aileden miRNA'ları ayırt etmenin etkisi, stem-loop yöntemi kadar iyi olmamalıdır.Her bir ters transkripsiyon kiti, gene özgü primerlerin (gövde halkaları) konsantrasyonu için gereksinimlere sahiptir.MiRNA için kullanılan dahili referans U6'dır.Stem-loop inversiyon işleminde, bir U6 tüpü ayrı ayrı ters çevrilmeli ve U6'nın ön ve arka primerleri doğrudan eklenmelidir.Hem circRNA hem de lncRNA, HKG'leri dahili referans olarak kullanabilir.İçindecDNA tespiti,
RNA ile ilgili bir sorun yoksa, cDNA'nın da iyi olması gerekir.Bununla birlikte, deneyin mükemmelliği aranıyorsa, gDNA'yı cd'lerden ayırt edebilen dahili bir referans geni (Referans geni, RG) kullanmak en iyisidir.Genel olarak, RG bir temizlik genidir., HKG) Şekil 10'da gösterildiği gibi;O sırada soya fasulyesi depolama proteini yapıyordum ve dahili referans olarak intron içeren aktin7 kullandım.gDNA'da bu primerin büyütülmüş fragmanının boyutu 452 bp idi ve cDNA bir şablon olarak kullanılmışsa, 142 bp idi.Daha sonra test sonuçları, cDNA'nın bir kısmının aslında gDNA tarafından kontamine olduğunu buldu ve ayrıca ters transkripsiyon sonucunda herhangi bir sorun olmadığını ve bunun PCR için bir şablon olarak kullanılabileceğini kanıtladı.Agaroz jel elektroforezini doğrudan cDNA ile çalıştırmak yararsızdır ve ikna edici olmayan yaygın bir banttır.

Şekil 10 cDNA tespiti

qPCR koşullarının belirlenmesikitin protokolüne göre genellikle sorun değil, esas olarak tm değeri adımında.Primer tasarımı sırasında bazı primerler iyi tasarlanmadıysa ve bu da tm değeri ile teorik 60°C arasında büyük bir farka neden oluyorsa, cDNA'nın numuneler karıştırıldıktan sonra primerlerle bir gradyan PCR çalıştırması ve TM değeri olarak bantsız sıcaklığı ayarlamaktan kaçınmaya çalışması önerilir.

Veri analizi

Geleneksel bağıl floresan kantitatif PCR işleme yöntemi temel olarak 2'ye göredir.-ΔΔCT.Veri işleme şablonu.

İlgili ürünler:

Gerçek Zamanlı PCR Kolay^TM –takman

Gerçek Zamanlı PCR Kolay^TM –SYBR YEŞİL I

RT Easy I (ilk sarmal cDNA sentezi için Master Premix)

RT Easy II(qPCR için ilk sarmal cDNA sentezi için Master Premix)