Ⅰ. Reaksiyon sisteminin hassasiyetini artırın:
1. Ayrı yüksek kaliteli RNA:
Başarılı cDNA sentezi, yüksek kaliteli RNA'dan gelir.Yüksek kaliteli RNA, en azından toplam daha uzun süre sağlamalıdır ve EDTA veya SDS gibi kayıt enzimleri içermeyen inhibitörler içermez.RNA'nın kalitesi, cDNA'ya kopyalayabileceğiniz dizi bilgisinin maksimum değerini belirler.Genel RNA saflaştırma yöntemi, izoosiyanat/asidofenol kullanımının bir adım yöntemidir.RNaz kirliliğini önlemek için, RNaz açısından zengin bir numuneden (pankreas gibi) ayrılan RNA, yüksek kaliteli RNA'yı kurtarmak için formaldehit depolanmasını gerektirir ki bu, uzun süreli depolama için daha da fazladır.Sıçan karaciğerinden ekstrakte edilen RNA, suda bir haftalık depolamanın ardından temel olarak bozulurken, sıçan dalağından ekstrakte edilen RNA, suda üç yıl saklamanın ardından stabil kaldı.Ek olarak, 4 kb'den büyük transkriptler, küçük transkriptlere göre iz RNaz bozulmasına karşı daha hassastır.Depolama RNA numunesinin stabilitesini arttırmak için, RNA bir iyon metalamin içinde çözülebilir ve -70 °C'de saklanır.RNA'yı kurtarmak için kullanılan tilid, RNA'yı bozan muhtelif bir nesne içermemelidir.Pankreastan elde edilen RNA, metalamin içinde en az bir yıl saklanabilir.RNA'yı kullanmaya hazır olduğunuzda, RNA'yı çöktürmek için aşağıdaki yöntemleri kullanabilirsiniz: 0,2 m ve etanol hacminin 4 katına kadar NaCl ekleyin, oda sıcaklığında 3-5 dakika ve 10.000 × g santrifüjde 5 dakika.
2. RNaseH aktivitesi (RNaseH-) olmadan ters transkriptaz kullanın：
RNaz inhibitörleri genellikle cDNA sentezinin uzunluğunu ve verimini artırmak için ters transkripsiyon reaksiyonlarına eklenir.RNaz inhibitörü, tamponların ve DTT gibi indirgeyici ajanların varlığında birinci zincir sentez reaksiyonuna eklenir çünkü ön cDNA sentez işlemi inhibitörü denatüre eder, böylece RNA'yı bozan bağlı RNaz'ları serbest bırakır.Protein RNaz inhibitörü, yalnızca RNaz A, B, C tarafından RNA'nın parçalanmasını önler ve RNazların ciltte kalmasını engellemez, bu nedenle bu inhibitörlerin kullanılmasına rağmen RNazların parmaklardan verilmemesine özen gösterilmelidir.
Ters transkriptaz, RNA'nın cDNA'ya dönüşümünü katalize eder.Hem M-MLV hem de AMV, kendi polimeraz aktivitelerine ek olarak endojen RNaseH aktivitesine sahiptir.RNaseH aktivitesi, RNA şablonları ile DNA primerleri veya cDNA uzatma şeritleri arasında oluşan heterozigot şeritler için polimeraz aktivitesi ile rekabet eder ve DNA komplekslerinde RNA: RNA şeritlerini bozar.RNaseH aktivitesi tarafından bozulan RNA şablonları artık cDNA sentezi için etkili substratlar olarak kullanılamaz, bu da cDNA sentezinin verimini ve uzunluğunu azaltır.Bu nedenle, ters transkriptazın RNaseH aktivitesini ortadan kaldırmak veya büyük ölçüde azaltmak büyük fayda sağlayacaktır.
SuperScriptⅡ ters transkriptaz, RNaseH-'nin MMLV ters transkriptazı ve termoScript ters transkriptaz, RNaseH-'nin AMV'si, MMLV ve AMV'den daha fazla tam uzunlukta cDNA verdi.RT-PCR duyarlılığı, sentezlenen cDNA miktarından etkilenir.ThermoScript, AMV'den çok daha hassastır.RT-PCR ürünlerinin boyutu, özellikle daha büyük Cdna'ları klonlarken, ters transkriptazın cDNA'yı sentezleme yeteneği ile sınırlıdır.MMLV ile karşılaştırıldığında SuperScripⅡ, uzun RT-PCR ürünlerinin verimini önemli ölçüde artırdı.RNaseH-'nin ters transkriptazı da termal kararlılığı artırır, bu nedenle reaksiyon normalden daha yüksek sıcaklıklarda (37-42°C) gerçekleştirilebilir.Önerilen sentez koşulları altında oligo(dT) primerleri ve 10μCi [alpha-p]dCTP kullanıldı.Birinci zincirin toplam üretimi, TCA çökeltme yöntemi kullanılarak hesaplandı.Tam uzunluktaki cDNA, bir alkalin agaroz jelinde boyuta göre sıralanmış şerit çıkarma ve sayma kullanılarak analiz edildi.
3. Ters transkripsiyonun ısı koruma sıcaklığını artırın:
Daha yüksek tutma sıcaklığı, RNA'nın ikincil yapısının açılmasına ve reaksiyon veriminin artmasına yardımcı olur.Çoğu RNA şablonu için, RNA ve primeri tampon veya tuz olmadan 65°C'de tutmak ve ardından bunları hızla buz üzerinde soğutmak, ikincil yapıların çoğunu ortadan kaldırır ve primerlerin bağlanmasına izin verir.Bununla birlikte, bazı şablonlar, termal denatürasyondan sonra bile hala ikincil yapıya sahiptir.Bu zor şablonların amplifikasyonu, ThermoScript ters transkriptaz kullanılarak ve amplifikasyonu iyileştirmek için ters transkriptaz reaksiyonunu daha yüksek sıcaklıklara yerleştirerek gerçekleştirilebilir.Daha yüksek tutma sıcaklıkları, özellikle cDNA sentezi gene özgü primerler (GSPS) kullanılarak yapıldığında özgüllüğü de artırabilir (bkz. Bölüm 3).GSP kullanılıyorsa, astarın Tm değerinin beklenen tutma sıcaklığı ile aynı olduğundan emin olun.60°C'nin üzerinde oligo(dT) ve rastgele primerler kullanmayın.Rastgele primerlerin 60°C'ye çıkmadan önce 25°C'de 10 dakika tutulması gerekir.Daha yüksek ters transkripsiyon sıcaklıkları kullanmaya ek olarak, RNA/primer karışımını 65°C denatüre sıcaklığından ters transkripsiyon tutma sıcaklığına doğrudan aktararak ve önceden ısıtılmış 2x reaksiyon karışımı (cDNA termal başlatma sentezi) ekleyerek özgüllük geliştirilebilir.Bu yaklaşım, düşük sıcaklıklarda meydana gelen moleküller arası baz eşleşmesini önlemeye yardımcı olur.Bir PCR cihazının kullanılması, RT-PCR için gereken birçok sıcaklık anahtarını basitleştirir.
Tth ısıyla stabilize edilmiş polimeraz, Mg2+ varlığında DNA polimeraz ve Mn2+ varlığında RNA polimeraz gibi davranır.65 ° C'ye kadar ısı tutabilir.Bununla birlikte, PCR sırasında Mn2+'nin varlığı aslına uygunluğu azaltır, bu da Tth polimerazı cDNA klonlaması gibi yüksek hassasiyetli amplifikasyon için daha az uygun hale getirir.Ek olarak, Tth, duyarlılığı azaltan ters transkripsiyonda daha az etkilidir ve tek bir enzim ters transkripsiyon ve PCR gerçekleştirebildiğinden, ters transkripsiyon olmadan kontrol reaksiyonları, cDNA'nın amplifiye ürünlerini kontamine genomik DNA'nın ürünlerinden ayırt etmek için kullanılamaz.
4. Ters transkripsiyonu destekleyen katkı maddesi:
Birinci zincir sentez reaksiyonuna gliserin ve DMSO dahil katkı maddelerinin eklenmesi, nükleik asit çift sarmalının stabilitesini azaltabilir ve RNA ikincil yapısını çözebilir.SuperScriptⅡ veya MMLV'nin etkinliğini etkilemeden %20'ye kadar gliserin veya %10'a kadar DMSO eklenebilir.AMV ayrıca aktiviteyi azaltmadan %20'ye kadar gliserolü tolere edebilir.RT-PCR'nin SuperScriptⅡ ters transkripsiyon reaksiyonundaki hassasiyetini en üst düzeye çıkarmak için %10 gliserol eklenebilir ve 45°C'de yalıtılabilir.PCR'ye retrotranskripsiyon-reaksiyon ürününün 1/10'u eklenirse, amplifikasyon reaksiyonundaki gliserol konsantrasyonu %0,4'tür ve bu PCR'yi inhibe etmek için yeterli değildir.
5. RNaseH işleme:
Duyarlılık, PCR'den önce cDNA sentez reaksiyonlarını RNaseH ile işleyerek geliştirilebilir.Bazı şablonlar için, cDNA sentez reaksiyonundaki RNA'nın, amplifiye ürünlerin bağlanmasını engellediği, bu durumda RNaseH işleminin duyarlılığı artırabileceği düşünülmektedir.Genel olarak, RNaseH tedavisi, düşük kopyalı yumrulu scherosis gibi nispeten uzun tam uzunlukta bir cDNA hedef şablonunun amplifikasyonu için gereklidir.Bu zor şablon için RNaseH, SuperScriptⅡ veya AMV tarafından sentezlenen cDNA tarafından üretilen sinyali geliştirdi.Çoğu RT-PCR reaksiyonu için, RNaseH tedavisi isteğe bağlıdır çünkü 95°C yalıtımlı PCR denatürasyon adımı tipik olarak RNA'yı RNA:DNA kompleksinden hidrolize eder.
6. Küçük miktarlarda RNA'yı tespit etmek için geliştirilmiş yöntemler:
RT-PCR, yalnızca küçük miktarlarda RNA mevcut olduğunda özellikle zordur.RNA ayrımı sırasında taşıyıcı olarak glikojen eklenmesi, küçük numunelerin verimini artırmaya yardımcı olur.Trizol ile aynı anda RNaz içermeyen bir glikojen eklenebilir.Glikojen suda çözünür ve sonraki çökelmeye yardımcı olmak için RNA ile su fazında kalabilir.Önerilen RNaz içermeyen glikojen konsantrasyonu, 50 mg doku veya 106 kültürlenmiş hücreden daha az numuneler için 250 μg/ml'dir.
SuperScriptⅡ kullanılarak ters transkripsiyon reaksiyonlarına asetillenmiş BSA'nın eklenmesi hassasiyeti artırabilir ve az miktarda RNA için, SuperScriptⅡ miktarını azaltmak ve 40 birim RnaseOut nükleaz inhibitörü eklemek saptama seviyesini iyileştirebilir.RNA ayrımında glikojen kullanılıyorsa, SuperScriptⅡ kullanılarak transkripsiyon reaksiyonlarını tersine çevirmek için BSA veya RNase inhibitörlerinin eklenmesi yine de önerilir.
Ⅱ. RT-PCR'nin özgüllüğünü artırın
1. cNDA sentezi：
Birinci sarmal cDNA sentezini başlatmak için üç farklı yöntem kullanılabilir ve her yöntemin nispi özgüllüğü, sentezlenen cDNA'nın miktarını ve tipini etkiler.
Rastgele primer yöntemi, üç yöntemden en az spesifik olanıdır.Primerler, kısa, kısmi uzunlukta cDNA üretmek için transkript boyunca birçok bölgede tavlanır.Bu yöntem genellikle ikincil yapısal bölgelere veya ters transkriptazın kopyalayamadığı sonlandırma bölgelerine sahip RNA şablonlarından 5' terminal dizileri ve cDNA elde etmek için kullanılır.En uzun cDNA'yı elde etmek için, her bir RNA numunesindeki primerlerin RNA'ya oranının ampirik olarak belirlenmesi gerekir.Rastgele primerlerin başlangıç konsantrasyonu, 20μl reaksiyon sistemi başına 50 ila 250 ng arasında değişir.Rastgele primerler kullanılarak toplam RNA'dan sentezlenen cDNA, esas olarak ribozomal RNA olduğundan, genellikle şablon olarak poli(A)+RNA seçilir.
Oligo(dT) başlatma, rastgele primerlerden daha spesifiktir.Çoğu ökaryotik hücrede mRNA'nın 3' ucunda bulunan poli(A) kuyruğu ile melezleşir.Poli(A)+RNA, toplam RNA'nın kabaca %1 ila %2'si olduğundan, cDNA'nın miktarı ve karmaşıklığı, rastgele primerler kullanıldığında olduğundan çok daha azdır.Yüksek özgüllüğü nedeniyle, oligo(dT) genellikle RNA:primer oranı ve poli(A)+ seçimi için optimizasyon gerektirmez.20μl reaksiyon sistemi başına 0,5μg oligo(dT) kullanılması önerilir.oligo(dT)12-18 çoğu RT-PCR için uygundur.ThermoScript RT-PCR Sistemi, iyi termal kararlılığı nedeniyle oligo(dT)20 sağlar ve daha yüksek tutma sıcaklıkları için uygundur.
Gene özgü primerler (GSP), ters transkripsiyon adımı için en iyi spesifik primerlerdir.GSP, rasgele primerler veya oligo(dT) gibi tüm Rna'ları tavlamak yerine, spesifik olarak RNA hedef dizileriyle hibridize olabilen bir antisens oligonükleosiddir.PCR primerlerini tasarlamak için kullanılan kurallar, ters transkripsiyon reaksiyonu GSP'nin tasarımı için de geçerlidir.GSP, mRNA3' sonunda tavlanan amplifikasyon primeri ile aynı sekans olabilir veya GSP, ters amplifikasyon primeri ile akış aşağı tavlanacak şekilde tasarlanabilir.Bazı amplifiye edilmiş nesneler için, başarılı RT-PCR için birden fazla antisens primer tasarlamak gerekir çünkü hedef RNA'nın ikincil yapısı primerin bağlanmasını engelleyebilir.20μl'lik ilk zincir sentez reaksiyon sisteminde 1pmol antisens GSP kullanılması önerilir.
2. Ters transkripsiyonun ısı koruma sıcaklığını artırın:
GSP özgüllüğünden tam olarak yararlanmak için, yüksek termal kararlılığa sahip ters transkriptaz kullanılmalıdır.Isıya dayanıklı ters transkriptaz, reaksiyon sertliğini artırmak için daha yüksek sıcaklıklarda yalıtılabilir.Örneğin, bir GSP 55°C'de tavlanırsa, AMV veya M-MLV kullanılarak düşük titizlikle 37°C'de ters transkripsiyon yapılırsa GSP'nin özgüllüğünden tam olarak yararlanılmaz.Ancak, SuperScripⅡ ve ThermoScript 50°C veya daha yüksek sıcaklıklarda reaksiyona girerek daha düşük sıcaklıklarda üretilen spesifik olmayan ürünleri ortadan kaldırır.Maksimum özgüllük için, RNA/primer karışımı önceden ısıtılmış 2 x reaksiyon karışımının eklenmesiyle (cDNA sentezinin termal başlangıcı) doğrudan 65°C denatürasyon sıcaklığından ters transkripsiyon tutma sıcaklığına aktarılabilir.Bu, düşük sıcaklıklarda moleküller arasındaki baz eşleşmesini önlemeye yardımcı olur.Bir PCR cihazının kullanılması, RT-PCR için gereken birçok sıcaklık geçişini basitleştirir.
3. Genomik DNA kontaminasyonunu azaltın：
RT-PCR ile ilgili potansiyel bir zorluk, RNA'nın genomik DNA'yı kontamine etmesidir.Trizol Reaktifi gibi daha iyi RNA ayırma yöntemlerinin kullanılması, RNA preparasyonlarında genomik DNA kontaminasyonunu azaltır.Genomik DNA'dan üretilen ürünlerden kaçınmak için RNA, ters transkripsiyondan önce kontamine DNA'yı çıkarmak için amplifikasyon dereceli DnasⅠ ile işlenebilir.Numuneler, DNaseⅠ sindirimini sonlandırmak için 2.0 mM EDTA içinde 65°C'de 10 dakika tutuldu.EDTA, yüksek sıcaklıklarda meydana gelen magnezyum iyonuna bağlı RNA hidrolizini önlemek için magnezyum iyonlarını şelatlar.
Amplifiye cDNA'yı genom DNA amplifikasyon ürününden ayırmak için ayrılan ekson ile ayrı ayrı tavlanan primerler tasarlanabilir.cDNA'dan türetilen PCR ürünleri, kontamine genomik DNA'dan türetilenlerden daha kısa olacaktır.Belirli bir fragmanın genomik DNA'dan mı yoksa cDNA'dan mı olduğunu belirlemek için her bir RNA şablonu üzerinde ters transkripsiyon olmaksızın kontrollü bir deney de gerçekleştirilir.Ters transkripsiyon olmadan elde edilen PCR ürünleri genomdan türetilir.
İlgili ürün
-Tek adımlı kit, ters transkripsiyon ve PCR'nin aynı tüpte gerçekleştirilmesini sağlar.Yalnızca şablon RNA, spesifik PCR primerleri ve RNaz İçermeyen ddH eklemesi gerekir2O.
-RNA'nın gerçek zamanlı kantitatif analizi hızlı ve doğru bir şekilde gerçekleştirilebilir.
-Kit, reaksiyonun amplifikasyon verimliliğini ve özgüllüğünü etkili bir şekilde iyileştirmek için benzersiz bir Foregene ters transkripsiyon reaktifi ve benzersiz bir reaksiyon sistemi ile birleştirilmiş Foregene HotStar Taq DNA Polimeraz kullanır.
-Optimize edilmiş reaksiyon sistemi, reaksiyonun daha yüksek algılama hassasiyetine, daha güçlü termal stabiliteye ve daha iyi toleransa sahip olmasını sağlar.
RT Easy II(GDNase ile) GDNase ile Gerçek Zamanlı PCR için Birinci Dizi CDNA Sentezi için Ana Premiks
-Şablondaki gDNA'yı 2 dakika içinde kaldırabilen gDNA'yı etkili bir şekilde kaldırma yeteneği.
-Verimli ters transkripsiyon sistemi, ilk sarmal cDNA'nın sentezini tamamlamak yalnızca 15 dakika sürer.
-Karmaşık şablonlar: Yüksek GC içeriğine ve karmaşık ikincil yapıya sahip şablonlar da yüksek verimlilikle tersine çevrilebilir.
-Yüksek hassasiyetli ters transkripsiyon sistemi, pg düzeyinde şablonlar da yüksek kaliteli cDNA alabilir.
-Ters transkripsiyon sistemi yüksek termal stabiliteye sahiptir, optimum reaksiyon sıcaklığı 42 ℃'dir ve 50 ℃'de hala iyi ters transkripsiyon performansına sahiptir.
Gönderim zamanı: Mart-07-2023
