• Facebook
  • Linkedin
  • Youtube

Geleneksel ters transkriptazlar yüksek sıcaklıkları tolere edemezler (MMLV aktivitesi için en uygun sıcaklık 37-50°C ve AMV 42-60°C'dir).Daha karmaşık viral RNA, düşük sıcaklıklarda etkili bir şekilde cDNA'ya ters kopyalanamaz, bu da saptama verimliliği ile sonuçlanır İndirgeme.Geleneksel RT-qPCR genellikle iki anahtar enzimin (ters transkriptaz ve DNA polimeraz) katılımını gerektirir, bu da reaksiyon sisteminin çalışmasını basitleştirmeyi ve maliyeti düşürmeyi imkansız hale getirir.Burada iki yüksek sıcaklığa dayanıklı ters transkriptazı, TtH ve RevTaq'ı tanıtacağız.Bu iki enzim de DNA polimeraz işlevine sahiptir, bu nedenle iki işlevli enzimler olarak adlandırılırlar.

TtH DNA polimeraz

Termofilik bakteri Thermus thermophilus HB8'den türetilen TtH'yi duymuş olmalısınız.Mg2+ gibi iki değerlikli katyonların varlığında DNA polimeraz aktivitesine sahiptir.Taq enzimi gibi PCR reaksiyonlarında yaygın olarak kullanılır, ancak Taq enziminden daha yüksek ısı direncine sahiptir, bu nedenle yüksek GC içerikli şablonlarla PCR üzerinde de daha iyi bir etkiye sahiptir.

· Bu enzim temel olarak 3'→5' ekzonükleaz aktivitesine ve 5'→3' ekzonükleaz aktivitesine sahip değildir, dolayısıyla dideoksi dizileme için de kullanılabilir.

· Bu enzim RTaz aktivitesine sahiptir.Mn2+ varlığında, RTaz aktivitesi artacaktır.Bu özelliği kullanılarak ters transkripsiyon reaksiyonu ve PCR reaksiyonunu aynı tüpte yani tek adımlı RT-PCR gerçekleştirmek için kullanılabilir.Ancak Mn2+ varlığında RT-PCR'nin doğruluğu yüksek değildir.RT aktivitesinin, enzim H aktivitesi ile hiçbir ilgisi yoktur.

· Artan Tth-DNA polimeraz aktivitesi (pH9, optimum +55℃~+70℃, maksimum +95℃), RNA ikincil yapısının neden olduğu sorunların üstesinden gelir.Ortaya çıkan cDNA, Mg2+ iyonlarının mevcudiyetinde aynı enzimle PCR ile amplifiye edilebilir.

· Tth-DNA polimerazın yüksek sıcaklıklarda ters transkripsiyon ve DNA amplifikasyonu gerçekleştirme yeteneği, bu enzimi kantitatif RT-PCR, klonlama ve hücresel ve viral RNA'nın gen ekspresyon analizi için faydalı kılar.
· Tth-DNA polimeraz, RT-PCR'de RNA'yı 1kb'ye kadar büyütmek için kullanılır.

hükümsüz
 

Özellikler ve avantajlar

Tth DNA polimeraz:

• RT-PCR reaksiyonunda optimize edilmiş polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürün boyutunun en az 1000 bp olduğundan emin olun

• Modifiye edilmiş deoksiribonükleosit trifosfatı substrat olarak kabul edin

• RNase H aktivitesi ile ilgili değil

• Genellikle RNA'da bulunan yüksek ikincil yapıyla ilgili sorunların üstesinden gelmek için yüksek termal kararlılığa sahiptir

RevTaq RT-PCR DNA polimeraz

Ters transkriptaz aktivitesine sahip ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraz, yönlendirilmiş ve yapay evrim yoluyla elde edilen ters transkriptaz ve DNA polimeraz aktivitelerine sahip, tasarlanmış, yüksek ısıya dayanıklı, çift işlevli bir enzimdir.

· 95°C'de RevTaq RT-PCR DNA polimerazın yarı ömrü 40 dakikadan fazladır.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraz, doğrudan RNA şablonundan yüksek sıcaklıkta ters transkripsiyona izin verir ve daha fazla cDNA şablonu oluşturmak için ters transkripsiyon adımı birçok kez tekrarlanabilir.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraz, "sıfır adımlı" RT-PCR'ye (izotermal ters transkripsiyon adımı yok) izin verir, çünkü siklik PCR uzatma adımında, ters transkripsiyon ve DNA amplifikasyonu aynı anda meydana gelir.Bu aynı zamanda yüksek sıcaklıklarda ters transkripsiyon reaksiyonunu teşvik ederek RNA'daki güçlü ikincil yapının yüksek sıcaklıklarda eritilmesinde karşılaşılan sorunları en aza indirir.

· Aptamer bazlı hot-start formülü sayesinde, RevTaq RT-PCR DNA polimeraz, tavlama ve uzatma sıcaklığı 57°C'den yüksek olduğunda daha iyi sonuçlar verecektir.

· Enzim ısıya dayanıklı olduğundan, çok yüksek erime noktalarına (>60°C) sahip primerler ve problar tasarlamanız önerilir.

· Tavlama/uzatma adımının sıcaklığının, reaksiyon kurulum işlemi sırasında bir sıcaklık gradyanı aracılığıyla optimize edilmesi önerilir.

· Sıcaklık ne kadar yüksek olursa, PCR'nin özgüllüğü de o kadar yüksek olur.Ters transkripsiyon döngüsü genellikle PCR döngüsünden daha yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir, çünkü DNA Primer:RNA Template hibridizasyonu genellikle DNA Primer:cDNA Template dubleksinden daha yüksek bir erime noktasına sahiptir.

· RevTaq RT-PCR DNA polimeraz genetik olarak tasarlanmış ve optimize edilmiştir ve amplikon boyutu 60-300 bp arasındadır.

RevTaq RT-PCR DNA polimeraz tespit limiti 4 kopyaya/İki (2)

Optimize edilmiş reaksiyon sistemi (yüksek erime noktalı primerlerin oluşturulması) şekilde gösterilmiştir.RevTaq RT-PCR DNA polimeraz güdümlü RT-PCR, TaqPath 1 adımlı RT-qPCR ana karışımından daha iyi hassasiyet ve daha düşük algılama Örnek seyreltme gradyanı gösterir.

Daha fazla avantaj:

Hızlı başlatma işlevi → İlk termal denatürasyon adımı atlanabilir.

Hot-start aptamer formülü → Hemen %100 enzim aktivitesi sağlar ve düşük sıcaklıklarda (<57°C) non-spesifik amplifikasyonu önler.

Bölünme işlevi → RevTaq RT-PCR DNA polimeraz ham reaksiyon numunelerini de işleyebildiğinden, RNA ekstraksiyon adımı atlanır.Sıcak bir RT-PCR döngüsünde ökaryotların, bakterilerin ve virüslerin hücre zarlarını anında yok edebilir.

IVD hammadde seviyesi → yüksek kalite standartları ve son derece rekabetçi fiyatlar


Gönderim zamanı: 12 Ağustos 2021