genel bakış
Transgenik bitkilerin hızlı tanımlanması
Metin/Tong Yucheng
Deneysel operasyon/Han Ying
Editör/Wen Youjun
Kelimeler/1600+
Önerilen okuma süresi/8-10 dakika
Transgenik bitkilerin hızlı tanımlanması
Laboratuvara yeni başlayan biri olarak, düşük dönüşüm oranına sahip bir grup bitkiden pozitif bitkileri elemek iyi bir iş değildir.Öncelikle çok sayıda örnekten tek tek DNA ekstraksiyonu yapılmalı ve daha sonra PCR ile yabancı genler tespit edilmelidir.Bununla birlikte, sonuçlar genellikle boşluklar ve ara sıra birkaç öğe içeren bantlardır, ancak gözden kaçan algılamaların mı yoksa yanlış algılamaların mı olduğunu belirlemek imkansızdır..Böyle deneysel süreç ve sonuçlarla yüzleşmek çok mu çaresiz?Endişelenmeyin, kardeşim size transgenik pozitif bitkileri nasıl kolay ve doğru bir şekilde eleyeceğinizi öğretiyor.
Aşama 1: Tasarım algılama primerleri
Test edilecek örneğe göre tespit edilecek endojen geni ve eksojen geni belirleyin ve primer tasarımı için gende temsili bir 100-500bp dizisi seçin.İyi primerler, tespit sonuçlarının doğruluğunu sağlayabilir ve tespit süresini kısaltabilir (yaygın olarak kullanılan tespit primerleri için eke bakın).
Not:
Yeni tasarlanan primerlerin, büyük ölçekli tespit gerçekleştirmeden önce reaksiyon koşullarını optimize etmesi ve tespitin doğruluğunu, kesinliğini ve tespit limitini doğrulaması gerekir.
Adım 2:Deneysel protokol geliştirin
Pozitif kontrol: PCR reaksiyon sisteminin ve koşullarının normal olup olmadığını belirlemek için hedef fragmanı içeren saflaştırılmış DNA'yı şablon olarak kullanın.
Negatif/boş kontrol: Bir DNA şablonu veya ddH kullanın2PCR sisteminde bir kontaminasyon kaynağı olup olmadığını tespit etmek için şablon olarak hedef fragmanı içermeyen O.
Dahili referans kontrolü: Şablonun PCR ile tespit edilip edilemeyeceğini değerlendirmek için test edilecek numunenin endojen geninin primer/prob kombinasyonunu kullanın.
Not:
Deneysel sonuçların geçerliliğini değerlendirmek için her test için pozitif, negatif/boş kontroller ve dahili kontrol kontrolleri ayarlanmalıdır.
Aşama 3: deney hazırlığı
Kullanmadan önce, çözeltinin eşit şekilde karışıp karışmadığını gözlemleyin.Çökelti bulunursa, kullanımdan önce talimatlara göre çözülmeli ve karıştırılmalıdır.Düzensiz iyon dağılımını önlemek için kullanımdan önce 2×PCR karışımının pipetlenmesi ve bir mikropipet ile tekrar tekrar karıştırılması gerekir.
Not:
Talimatları çıkarın ve dikkatlice okuyun ve talimatlara tam olarak uygun olarak deney öncesi hazırlıkları yapın.
Adım 4: PCR reaksiyon sistemini hazırlayın
Deney protokolüne göre, primerleri karıştırın, H2O, 2×PCR karışımı, santrifüjleyin ve her bir reaksiyon tüpüne dağıtın.
Not:
Büyük ölçekli veya uzun süreli testler için, PCR ürünlerinin neden olduğu aerosol kontaminasyonunu etkili bir şekilde önleyebilen UNG enzimi içeren bir PCR reaksiyon sisteminin kullanılması önerilir.
5. Adım: Reaksiyon şablonu ekleyin
Direct PCR teknolojisini kullanarak, sıkıcı nükleik asit saflaştırma işlemine gerek yoktur.Numune şablonu 10 dakika içinde hazırlanabilir ve karşılık gelen PCR reaksiyon sistemine eklenebilir.
Not:
Lizis yöntemi daha iyi tespit etkisine sahiptir ve elde edilen ürün çoklu tespit reaksiyonları için kullanılabilir.
5.1: Yaprakların doğrudan PCR'si
Kılavuzdaki resmin boyutuna göre yaprak dokusunu 2-3mm çapında kesin ve PCR reaksiyon sistemine yerleştirin.
Not: Yaprak parçalarının tamamen PCR reaksiyon solüsyonuna batırıldığından emin olun ve aşırı yaprak dokusu eklemeyin.
5.2: Yaprak parçalama yöntemi
Yaprak dokusunu 5-7 mm çapında kesin ve bir santrifüj tüpüne yerleştirin.Olgun yaprakları seçerseniz, lütfen yaprağın ana damarının dokularını kullanmaktan kaçının.50ul Tampon P1 lizatı bir santrifüj tüpüne pipetleyerek lizatın yaprak dokusunu tamamen batırmasını sağlayın, bir termal döngüleyiciye veya metal bir banyoya yerleştirin ve 95°C'de 5-10 dakika parçalayın.
50ul Tampon P2 nötralizasyon solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın.Nihai lizat, bir şablon olarak kullanılabilir ve PCR reaksiyon sistemine eklenebilir.
Not: Şablon miktarı, PCR sisteminin %5-10'u arasında olmalı ve %20'yi geçmemelidir (örneğin, 20μl PCR sisteminde, 4μl'den fazla olmamak kaydıyla 1-2μl lizis tamponu ekleyin).
Adım 6: PCR Reaksiyonu
PCR reaksiyon tüpünü santrifüjledikten sonra amplifikasyon için bir PCR cihazına yerleştirin.
Not:
Reaksiyon, amplifikasyon için saflaştırılmamış şablon kullanır, dolayısıyla amplifikasyon döngülerinin sayısı, saflaştırılmış DNA şablonu kullanıldığında olduğundan 5-10 döngü daha fazladır.
Adım 7: Elektroforez tespiti ve sonuç analizi
M:100bp DNA Merdiveni
1\4: Saflaştırılmış DNA yöntemi
2\5: Doğrudan PCR yöntemi
3\6: Boş kontrol
Kalite kontrol:
Deneyde ayarlanan çeşitli kontrollerin test sonuçları aşağıdaki koşulları karşılamalıdır.Aksi halde sorunun kaynağı araştırılmalı, sorun giderildikten sonra tekrar test yapılmalıdır.
Tablo 1. Çeşitli kontrol gruplarının normal test sonuçları
*Plazmid pozitif kontrol olarak kullanıldığında, endojen gen testi sonucu negatif olabilir
Sonuç yargısı:
A. Numunenin endojen geninin test sonucunun negatif olması, normal PCR tespitine uygun DNA'nın numuneden ekstrakte edilemeyeceğini veya ekstrakte edilen DNA'nın PCR reaksiyon inhibitörleri içerdiğini ve DNA'nın tekrar ekstrakte edilmesi gerektiğini gösterir.
B. Numunenin endojen geninin test sonucunun pozitif olması ve eksojen genin test sonucunun negatif olması, sıradan PCR tespiti için uygun DNA'nın numuneden çıkarıldığını ve numunede XXX geninin tespit edilmediğine karar verilebileceğini gösterir.
C. Numunenin endojen geninin test sonucunun pozitif olması ve eksojen genin test sonucunun pozitif olması, normal PCR tespiti için uygun DNA'nın numuneden çıkarıldığını ve numune DNA'sının XXX genini içerdiğini gösterir.Doğrulama deneyleri ayrıca gerçekleştirilebilir.
Adım 8: Tespit primerlerini tasarlayın
Deneyden sonra, çevre kirliliğini önlemek için deney alanını silmek için %2 sodyum hipoklorit solüsyonu ve %70 etanol solüsyonu kullanın.
Ek
Tablo 2. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin genel PCR tespiti için yaygın olarak kullanılan primerler
Referans belgesi:
SN/T 1202-2010, Gıdalarda genetiği değiştirilmiş bitki bileşenleri için Kalitatif PCR saptama yöntemi.
Tarım Bakanlığı Duyurusu 1485-5-2010, Genetiği değiştirilmiş bitkiler ve bunların ürünleri-pirinç M12 ve türevlerinin içeriklerinin test edilmesi.
Gönderim zamanı: Haz-09-2021
