一、Reaksiyon sisteminin hassasiyetini artırın：

1. Yüksek kaliteli RNA'yı izole edin:

Başarılı cDNA sentezi, yüksek kaliteli RNA'dan gelir.Yüksek kaliteli RNA en azından tam uzunlukta olmalı ve EDTA veya SDS gibi ters transkriptaz inhibitörleri içermemelidir.RNA'nın kalitesi, cDNA'ya kopyalayabileceğiniz maksimum dizi bilgisi miktarını belirler.Yaygın bir RNA saflaştırma yöntemi, guanidin izotiyosiyanat/asit fenol kullanan tek adımlı bir yöntemdir.Eser miktarda RNaz ile kontaminasyonu önlemek için, RNaz bakımından zengin numunelerden (pankreas gibi) izole edilen RNA'nın, özellikle uzun süreli depolama için yüksek kaliteli RNA'yı korumak üzere formaldehit içinde saklanması gerekir.Sıçan karaciğerinden ekstrakte edilen RNA, bir hafta suda bekletildikten sonra temel olarak bozulurken, sıçan dalağından ekstrakte edilen RNA, 3 yıl suda saklandıktan sonra stabil kaldı.Ek olarak, 4 kb'den uzun transkriptler, küçük transkriptlere göre eser RNazlar tarafından bozulmaya karşı daha hassastır.Depolanan RNA örneklerinin stabilitesini artırmak için RNA deiyonize formamid içinde çözülebilir ve -70°C'de saklanabilir.RNA'yı korumak için kullanılan formamid, RNA'yı bozan kalıntılardan arınmış olmalıdır.Pankreastan gelen RNA formamid içinde en az bir yıl saklanabilir.RNA kullanmaya hazırlanırken, RNA'yı çöktürmek için şu yöntemi kullanabilirsiniz: 0,2 M ve etanol hacminin 4 katına NaCl ekleyin, 3-5 dakika oda sıcaklığında bekletin ve 5 dakika 10,000×g'de santrifüjleyin.

2. RNaseH-etkin olmayan (RNaseH-) ters transkriptazı kullanın:

RNaz inhibitörleri genellikle cDNA sentezinin uzunluğunu ve verimini artırmak için ters transkripsiyon reaksiyonlarına eklenir.RNaz inhibitörleri, bir tampon ve bir indirgeyici ajan (DTT gibi) varlığında birinci sarmal sentez reaksiyonu sırasında eklenmelidir, çünkü cDNA sentezinden önceki süreç inhibitörü denatüre eder, böylece RNA'yı bozabilen bağlı RNaz'ı serbest bırakır.Protein RNaz inhibitörleri sadece RNaz A, B, C tarafından RNA'nın bozunmasını engeller ve RNaz'ın ciltte kalmasını engellemez, bu nedenle bu inhibitörlerin kullanılmasına rağmen RNaz'ı parmaklarınızdan sokmamaya dikkat edin.

Ters transkriptaz, RNA'nın cDNA'ya dönüşümünü katalize eder.Hem M-MLV hem de AMV, kendi polimeraz aktivitelerine ek olarak endojen RNaseH aktivitesine sahiptir.RNaseH aktivitesi ve polimeraz aktivitesi, RNA şablonu ile DNA primeri veya cDNA uzatma ipliği arasında oluşan hibrit iplik için birbiriyle rekabet eder ve RNA:DNA kompleksindeki RNA ipliğini bozar.RNaseH aktivitesi tarafından bozulan RNA şablonu artık cDNA sentezi için etkili bir substrat olarak hizmet edemez, bu da cDNA sentezinin verimini ve uzunluğunu azaltır.Bu nedenle, ters transkriptazın RNaseH aktivitesini ortadan kaldırmak veya büyük ölçüde azaltmak faydalı olacaktır.

SuperScript Ⅱ ters transkriptaz, RNaseH- MMLV ters transkriptaz ve termoScript ters transkriptaz, RNaseH- AMV, MMLV ve AMV'den daha fazla miktarda ve tam uzunlukta cDNA elde edebilir.RT-PCR duyarlılığı, cDNA sentezi miktarından etkilenecektir.ThermoScript, AMV'den çok daha hassastır.RT-PCR ürünlerinin boyutu, özellikle daha büyük cDNA'ları klonlarken, ters transkriptazın cDNA'yı sentezleme yeteneği ile sınırlıdır.MMLV ile karşılaştırıldığında SuperScripⅡ, uzun RT-PCR ürünlerinin verimini önemli ölçüde artırdı.RNaseH-ters transkriptaz ayrıca termostabiliteyi arttırır, bu nedenle reaksiyon normal 37-42°C'den daha yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir.Önerilen sentez koşulları altında, oligo(dT) primer ve 10 μCi [α-P]dCTP kullanın.Birinci ipliğin toplam verimi, TCA çökeltme yöntemi kullanılarak hesaplandı.Tam uzunluktaki cDNA, eksize edilen ve bir alkalin agaroz jel üzerinde sayılan boyuta göre sıralanmış bantlar kullanılarak analiz edildi.

3. Ters transkripsiyon için inkübasyon sıcaklığını yükseltin：

Daha yüksek bir inkübasyon sıcaklığı, RNA ikincil yapısının açılmasına yardımcı olarak reaksiyon verimini arttırır.Çoğu RNA şablonu için, RNA ve primerleri 65°C'de tampon veya tuz olmadan inkübe etmek ve ardından buz üzerinde hızlı soğutma, ikincil yapıların çoğunu ortadan kaldıracak ve primerlerin bağlanmasına izin verecektir.Bununla birlikte, bazı şablonlar, ısı denatürasyonundan sonra bile hala ikincil yapılara sahiptir.Bu zor şablonların amplifikasyonu, ThermoScript Ters Transkriptaz kullanılarak ve amplifikasyonu iyileştirmek için ters transkripsiyon reaksiyonunu daha yüksek bir sıcaklığa yerleştirerek gerçekleştirilebilir.Daha yüksek inkübasyon sıcaklıkları, özellikle cDNA sentezi için gene özgü primerler (GSP) kullanıldığında (bkz. Bölüm 3) özgüllüğü artırabilir.GSP kullanılıyorsa, primerlerin Tm'sinin beklenen inkübasyon sıcaklığı ile aynı olduğundan emin olun.60°C'nin üzerinde oligo(dT) ve rastgele primerler kullanmayın.Rastgele primerler, 60°C'ye yükselmeden önce 25°C'de 10 dakika inkübasyon gerektirir.Daha yüksek bir ters transkripsiyon sıcaklığı kullanmaya ek olarak, RNA/primer karışımını 65°C denatürasyon sıcaklığından ters transkripsiyon inkübasyon sıcaklığına doğrudan aktararak ve önceden ısıtılmış 2x reaksiyon karışımı (cDNA hot-start sentezi) ekleyerek özgüllük de geliştirilebilir.Bu yaklaşım, düşük sıcaklıklarda meydana gelen moleküller arası baz eşleşmesini önlemeye yardımcı olur.RT-PCR için gereken çoklu sıcaklık değişimi, bir termal döngüleyici kullanılarak basitleştirilebilir.

Tth termostabil polimeraz, Mg2+ varlığında bir DNA polimeraz ve Mn2+ varlığında bir RNA polimeraz gibi davranır.Maksimum 65°C sıcaklıkta sıcak tutulabilir.Bununla birlikte, PCR sırasında Mn2+'nin varlığı aslına uygunluğu azaltır, bu da Tth polimerazı cDNA'nın klonlanması gibi yüksek hassasiyetli amplifikasyon için daha az uygun hale getirir.Ek olarak, Tth düşük ters transkripsiyon etkinliğine sahiptir, bu da duyarlılığı azaltır ve ters transkripsiyon ve PCR tek bir enzimle gerçekleştirilebildiğinden, ters transkripsiyon olmadan kontrol reaksiyonları, kontamine genomik DNA ile cDNA amplifikasyon ürünlerini karşılaştırmak için kullanılamaz.Amplifikasyon ürünleri ayrıldı.

4. Ters transkripsiyonu destekleyen katkı maddeleri:

Nükleik asit çift sarmalının stabilitesini azaltabilen ve RNA'nın ikincil yapısını çözebilen birinci sarmal sentez reaksiyonuna gliserol ve DMSO dahil katkı maddeleri eklenir.SuperScript II veya MMLV etkinliğini etkilemeden %20'ye kadar gliserol veya %10'a kadar DMSO eklenebilir.AMV ayrıca aktivite kaybı olmaksızın %20'ye kadar gliserolü tolere edebilir.RT-PCR'nin SuperScriptⅡ ters transkripsiyon reaksiyonundaki duyarlılığını en üst düzeye çıkarmak için %10 gliserol eklenebilir ve 45°C'de inkübe edilebilir.PCR'ye ters transkripsiyon reaksiyonu ürününün 1/10'u eklenirse, amplifikasyon reaksiyonundaki gliserol konsantrasyonu %0,4'tür ve bu PCR'yi inhibe etmek için yeterli değildir.

5. RNaseH tedavisi:

PCR'den önce cDNA sentez reaksiyonlarının RNaseH ile işlenmesi hassasiyeti artırabilir.Bazı şablonlar için, cDNA sentez reaksiyonundaki RNA'nın amplifikasyon ürünlerinin bağlanmasını engellediği, bu durumda RNaseH işleminin duyarlılığı artırabileceği düşünülmektedir.Genel olarak, düşük kopya yumrulu scherosis II gibi daha uzun tam uzunluktaki cDNA hedef şablonlarını amplifiye ederken RNaseH tedavisi gereklidir.Bu zor şablon için RNaseH işlemi, SuperScript II veya AMV sentezlenmiş cDNA tarafından üretilen sinyali geliştirdi.Çoğu RT-PCR reaksiyonu için, RNaseH tedavisi isteğe bağlıdır, çünkü 95°C'deki PCR denatürasyon adımı genellikle RNA:DNA kompleksindeki RNA'yı hidrolize eder.

6. Küçük RNA Saptama Yönteminin Geliştirilmesi：

RT-PCR, yalnızca küçük miktarlarda RNA mevcut olduğunda özellikle zordur.RNA izolasyonu sırasında taşıyıcı olarak eklenen glikojen, küçük numunelerin verimini artırmaya yardımcı olur.RNaz içermeyen glikojen, Trizol eklenmesiyle aynı anda eklenebilir.Glikojen suda çözünür ve müteakip çökelmeye yardımcı olmak için RNA ile sulu fazda tutulabilir.50 mg'dan az doku veya 106 kültürlenmiş hücreden daha az numuneler için önerilen RNaz içermeyen glikojen konsantrasyonu 250 μg/ml'dir.

SuperScript II kullanılarak ters transkripsiyon reaksiyonuna asetillenmiş BSA eklenmesi duyarlılığı artırabilir ve az miktarda RNA için, SuperScript II miktarını azaltmak ve 40 ünite RNaseOut nükleaz inhibitörü eklemek algılama seviyesini artırabilir.RNA izolasyon işleminde glikojen kullanılıyorsa, ters transkripsiyon reaksiyonu için SuperScript II kullanırken yine de BSA veya RNase inhibitörü eklenmesi önerilir.

二、RT-PCR özgüllüğünü artırın

1. CND Assentezi:

Birinci sarmal cDNA sentezi, bağıl özgüllüğü sentezlenen cDNA'nın miktarını ve türünü etkileyen üç farklı yöntem kullanılarak başlatılabilir.

Rastgele primer yöntemi, üç yöntemden en az spesifik olanıydı.Primerler, kısa, kısmi uzunlukta cDNA'lar oluşturarak, transkript boyunca birden fazla bölgede tavlanır.Bu yöntem sıklıkla 5' uç dizileri elde etmek ve ikincil yapı bölgeleri veya ters transkriptaz tarafından kopyalanamayan sonlandırma bölgeleri olan RNA şablonlarından cDNA elde etmek için kullanılır.En uzun cDNA'yı elde etmek için, her bir RNA numunesindeki primerlerin RNA'ya oranının ampirik olarak belirlenmesi gerekir.Rastgele primerlerin başlangıç ​​konsantrasyonu, 20 ul reaksiyon başına 50 ila 250 ng arasında değişiyordu.Toplam RNA'dan rasgele primerler kullanılarak sentezlenen cDNA, öncelikle ribozomal RNA olduğundan, genellikle şablon olarak poli(A)+RNA seçilir.

Oligo(dT) primerleri rastgele primerlerden daha spesifiktir.Çoğu ökaryotik mRNA'nın 3' ucunda bulunan poli(A) kuyruğuna melezleşir.Poli(A)+ RNA, toplam RNA'nın yaklaşık %1 ila %2'si olduğundan, cDNA'nın miktarı ve karmaşıklığı rastgele primerlere göre çok daha azdır.Yüksek özgüllüğü nedeniyle, oligo(dT) genellikle RNA'nın primerlere oranının ve poli(A)+ seçiminin optimizasyonunu gerektirmez.20μl reaksiyon sistemi başına 0,5μg oligo(dT) kullanılması önerilir.oligo(dT)12-18 çoğu RT-PCR için uygundur.ThermoScript RT-PCR Sistemi, daha yüksek inkübasyon sıcaklıkları için daha iyi termal kararlılığı nedeniyle oligo(dT)20 sunar.

Gene spesifik primerler (GSP), ters transkripsiyon adımı için en spesifik primerlerdir.GSP, tüm RNA'lara bağlanan rastgele primerler veya oligo(dT)'den farklı olarak, RNA hedef sekansına spesifik olarak hibridize olabilen bir antisens oligonükleotittir.PCR primerlerini tasarlamak için kullanılan aynı kurallar, ters transkripsiyon reaksiyonlarında GSP tasarımı için de geçerlidir.GSP, mRNA'nın en 3' ucuna tavlanan amplifikasyon primeri ile aynı sekans olabilir veya GSP, ters amplifikasyon primerinin aşağı akışını tavlamak üzere tasarlanabilir.Bazı amplifiye denekler için, başarılı RT-PCR için birden fazla antisens primerin tasarlanması gerekir çünkü hedef RNA'nın ikincil yapısı primer bağlanmasını önleyebilir.20 µl birinci zincir sentez reaksiyonunda 1 pmol antisens GSP kullanılması tavsiye edilir.

2. Ters transkripsiyon için inkübasyon sıcaklığını yükseltin：

GSP özgüllüğünün tüm avantajlarından tam olarak yararlanmak için, daha yüksek termostabiliteye sahip bir ters transkriptaz kullanılmalıdır.Termostabil ters transkriptazlar, reaksiyon sıkılığını artırmak için daha yüksek sıcaklıklarda inkübe edilebilir.Örneğin, bir GSP 55°C'de tavlanırsa, 37°C'lik düşük katılıkta ters transkripsiyon için AMV veya M-MLV kullanılırsa GSP'nin özgüllüğünden tam olarak yararlanılmayacaktır.Ancak, SuperScript II ve ThermoScript 50°C veya daha yüksek sıcaklıklarda reaksiyona girebilir, bu da daha düşük sıcaklıklarda üretilen spesifik olmayan ürünleri ortadan kaldırır.Maksimum özgüllük için, RNA/primer karışımı doğrudan 65°C denatürasyon sıcaklığından ters transkripsiyon inkübasyon sıcaklığına aktarılabilir ve önceden ısıtılmış 2x reaksiyon karışımına (cDNA sentezi sıcak başlangıç) eklenebilir.Bu, düşük sıcaklıklarda moleküller arası baz eşleşmesini önlemeye yardımcı olur.RT-PCR için gereken çoklu sıcaklık geçişleri, bir termal döngüleyici kullanılarak basitleştirilebilir.

3. Genomik DNA kontaminasyonunu azaltır：

RT-PCR ile karşılaşılan potansiyel bir zorluk, RNA'daki genomik DNA'nın kontaminasyonudur.Trizol Reaktifi gibi iyi bir RNA izolasyon yöntemi kullanmak, RNA preparasyonunu kontamine eden genomik DNA miktarını azaltacaktır.Genomik DNA'dan türetilen ürünlerden kaçınmak için RNA, ters transkripsiyondan önce kontamine edici DNA'yı çıkarmak için amplifikasyon dereceli DNaz I ile işlenebilir.DNase I sindirimi, numunelerin 2.0 mM EDTA içinde 65°C'de 10 dakika inkübe edilmesiyle sonlandırıldı.EDTA, magnezyum iyonlarını şelatlayarak, yüksek sıcaklıklarda magnezyum iyonuna bağımlı RNA hidrolizini önleyebilir.

Amplifiye edilmiş cDNA'yı kontamine genomik DNA amplifikasyon ürünlerinden ayırmak için, her biri ayrı eksonlara bağlanan primerler tasarlanabilir.cDNA'dan türetilen PCR ürünleri, kontamine genomik DNA'dan türetilenlerden daha kısa olacaktır.Ek olarak, belirli bir fragmanın genomik DNA'dan mı yoksa cDNA'dan mı türetildiğini belirlemek için her bir RNA şablonu üzerinde ters transkripsiyon olmadan bir kontrol deneyi yapıldı.Ters transkripsiyon olmadan elde edilen PCR ürünü, genomdan türetilir.