• PCR, DNA'yı az miktarda DNA şablonundan çoğaltmak için kullanılan bir yöntemdir.RT-PCR, daha sonra amplifiye edilebilecek bir RNA kaynağından bir DNA şablonu üretmek için ters transkripsiyon kullanır.
• PCR ve RT-PCR tipik olarak uç nokta reaksiyonlarıdır; qPCR ve RT-qPCR ise mevcut şablon miktarını ölçmek için PCR reaksiyonu sırasında ürün sentezi hızının kinetiğini kullanır.
• Dijital PCR gibi daha yeni yöntemler, başlangıçtaki DNA şablonunun mutlak miktarının belirlenmesini sağlarken, izotermal PCR gibi yöntemler, güvenilir sonuçlar sağlamak için pahalı ekipman ihtiyacını azaltır.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA ve RNA dizilerini çoğaltmak ve tespit etmek için nispeten basit ve yaygın olarak kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir.Genellikle günler sürebilen geleneksel DNA klonlama ve amplifikasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PCR yalnızca birkaç saat gerektirir.PCR oldukça hassastır ve belirli dizilerin tespiti ve amplifikasyonu için minimum şablon gerektirir.Temel PCR yöntemleri, basit DNA ve RNA tespitinden daha da ilerlemiştir.Aşağıda, araştırma ihtiyaçlarınız için Enzo Life Sciences olarak sunduğumuz farklı PCR yöntemlerine ve reaktiflere genel bir bakış sunduk.Bilim adamlarının bir sonraki araştırma projelerinde kullanmak üzere PCR reaktiflerine hızlı bir şekilde erişmelerine yardımcı olmayı amaçlıyoruz!

PCR

Standart PCR için ihtiyacınız olan tek şey bir DNA polimeraz, magnezyum, nükleotidler, primerler, çoğaltılacak DNA şablonu ve bir termosikleyicidir.PCR mekanizması amacı kadar basittir: 1) çift sarmallı DNA (dsDNA) ısıyla denatüre edilir, 2) primerler tek DNA sarmallarına hizalanır ve 3) primerler DNA polimeraz tarafından uzatılır ve sonuçta iki kopya elde edilir. orijinal DNA ipliği.Bir dizi sıcaklık ve süre boyunca denatürasyon, tavlama ve uzama süreci, bir amplifikasyon döngüsü olarak bilinir (Şekil 1).

Döngünün her adımı, kullanılan şablon ve primer seti için optimize edilmelidir.Bu döngü yaklaşık 20-40 kez tekrarlanır ve amplifiye edilen ürün daha sonra tipik olarak agaroz jel ile analiz edilebilir (Şekil 2).

PCR oldukça hassas bir yöntem olduğundan ve tek reaksiyonlar için çok küçük hacimler gerektiğinden, birden fazla reaksiyon için bir ana karışımın hazırlanması tavsiye edilir.Ana karışım iyice karıştırılmalı ve reaksiyon sayısına göre bölünerek her reaksiyonun aynı miktarda enzim, dNTP ve primer içermesi sağlanmalıdır.Enzo Life Sciences gibi birçok tedarikçi, primerler ve DNA şablonu dışında zaten her şeyi içeren PCR karışımları da sunmaktadır.

Guanin/Sitosin açısından zengin (GC açısından zengin) bölgeler, standart PCR tekniklerinde bir zorluğu temsil eder.GC açısından zengin diziler, daha düşük GC içeriğine sahip dizilerden daha stabildir.Ayrıca GC açısından zengin diziler, saç tokası ilmekleri gibi ikincil yapılar oluşturma eğilimindedir.Sonuç olarak, GC açısından zengin çift sarmalların denatürasyon aşaması sırasında tamamen ayrılması zordur.Sonuç olarak, DNA polimeraz yeni ipliği hiçbir engel olmadan sentezleyemez.Daha yüksek bir denatürasyon sıcaklığı bunu iyileştirebilir ve daha yüksek bir tavlama sıcaklığına ve daha kısa tavlama süresine yönelik ayarlamalar, GC açısından zengin primerlerin spesifik olmayan bağlanmasını önleyebilir.Ek reaktifler GC açısından zengin dizilerin amplifikasyonunu artırabilir.DMSO, gliserol ve betain, GC etkileşimlerinin neden olduğu ikincil yapıların bozulmasına yardımcı olur ve böylece çift sarmalların ayrılmasını kolaylaştırır.

Sıcak Başlangıç ​​PCR'si

Spesifik olmayan amplifikasyon PCR sırasında ortaya çıkabilecek bir sorundur.PCR için kullanılan çoğu DNA polimeraz, 68°C ila 72°C arasındaki sıcaklıklarda en iyi şekilde çalışır.Ancak enzim daha düşük sıcaklıklarda da olsa daha düşük derecede de aktif olabilir.Tavlama sıcaklığının çok altındaki sıcaklıklarda, primerler spesifik olmayan bir şekilde bağlanabilir ve reaksiyon buz üzerinde kurulsa bile spesifik olmayan amplifikasyona yol açabilir.Bu, yalnızca belirli bir sıcaklığa ulaşıldığında DNA polimerazdan ayrılan polimeraz inhibitörlerinin kullanılmasıyla önlenebilir, dolayısıyla sıcak başlangıç ​​PCR terimi kullanılır.İnhibitör, polimerazı bağlayan ve başlangıç ​​denatürasyon sıcaklığında (tipik olarak 95°C) denatüre olan bir antikor olabilir.

Yüksek Sadakatli Polimeraz

DNA polimerazlar orijinal şablon dizisine oldukça doğru bir şekilde çoğalırken, nükleotid eşleşmesinde hatalar meydana gelebilir.Klonlama gibi uygulamalardaki uyumsuzluklar, transkriptlerin kesilmesine ve aşağı yönde yanlış çevrilmiş veya inaktif proteinlere neden olabilir.Bu uyumsuzlukları önlemek için "düzeltme" aktivitesine sahip polimerazlar tanımlanmış ve iş akışına dahil edilmiştir.İlk düzeltme polimerazı olan Pfu, 1991 yılında Pyrococcus furiosus'ta tanımlandı.Bu Pfu enzimi 3' ila 5' eksonükleaz aktivitesine sahiptir.DNA amplifiye edildikçe eksonükleaz, ipliğin 3' ucundaki uyumsuz nükleotidleri uzaklaştırır.Daha sonra doğru nükleotid değiştirilir ve DNA sentezi devam eder.Yanlış nükleotid dizilerinin tanımlanması, doğru nükleosid trifosfatın enzimle bağlanma afinitesine dayanır; burada verimsiz bağlanma, sentezi yavaşlatır ve doğru değişime izin verir.Pfu polimerazın düzeltme aktivitesi, Taq DNA polimerazına kıyasla son dizide daha az hatayla sonuçlanır.Son yıllarda başka düzeltme enzimleri de tanımlanmış ve DNA amplifikasyonu sırasındaki hata oranını daha da azaltmak için orijinal Pfu enziminde modifikasyonlar yapılmıştır.

RT-PCR

Ters transkripsiyon PCR veya RT-PCR, RNA'nın şablon olarak kullanılmasına izin verir.Ek bir adım, RNA'nın saptanmasına ve amplifikasyonuna olanak sağlar.RNA, ters transkriptaz kullanılarak tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters kopyalanır.RNA şablonunun kalitesi ve saflığı RT-PCR'nin başarısı için esastır.RT-PCR'nin ilk adımı bir DNA/RNA hibritinin sentezidir.Ters transkriptaz ayrıca hibritin RNA kısmını bozan bir RNase H fonksiyonuna da sahiptir.Tek sarmallı DNA molekülü daha sonra ters transkriptazın DNA'ya bağımlı DNA polimeraz aktivitesi ile cDNA'ya tamamlanır.Birinci iplikçik reaksiyonunun verimliliği amplifikasyon sürecini etkileyebilir.Bundan sonra cDNA'yı amplifiye etmek için standart PCR prosedürü kullanılır.RT-PCR ile RNA'yı cDNA'ya döndürme olanağının birçok avantajı vardır ve öncelikle gen ekspresyon analizi için kullanılır.RNA tek sarmallıdır ve çok kararsızdır, bu da onunla çalışmayı zorlaştırır.Genellikle biyolojik bir numunedeki RNA transkriptlerinin miktarını belirleyen qPCR'de ilk adım olarak hizmet eder.

qPCR ve RT-qPCR

Kantitatif PCR (qPCR), çok sayıda uygulama için nükleik asitleri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılır.RT-qPCR'de, RNA transkriptlerinin miktarı genellikle yukarıda açıklandığı gibi önce bunların cDNA'ya ters kopyalanmasıyla ölçülür ve ardından qPCR daha sonra gerçekleştirilir.Standart PCR'de olduğu gibi, DNA üç tekrarlanan adımla çoğaltılır: denatürasyon, tavlama ve uzatma.Ancak qPCR'de floresan etiketleme, PCR ilerledikçe verilerin toplanmasını sağlar.Bu tekniğin, mevcut yöntem ve kimya çeşitliliği nedeniyle birçok faydası vardır.

Boya bazlı qPCR'de (tipik olarak yeşil), floresan etiketleme, bir dsDNA bağlama boyası kullanılarak çoğaltılmış DNA moleküllerinin miktarının belirlenmesine olanak tanır.Her döngü sırasında floresans ölçülür.Floresan sinyali, kopyalanan DNA miktarıyla orantılı olarak artar.Dolayısıyla DNA “gerçek zamanlı” olarak ölçülür (Şekil 3).Boya bazlı qPCR'nin dezavantajları, aynı anda yalnızca bir hedefin incelenebilmesi ve boyanın numunede mevcut herhangi bir ds-DNA'ya bağlanabilmesidir.

Prob tabanlı qPCR'de, her örnekte aynı anda birçok hedef tespit edilebilir, ancak bu, primerlere ek olarak kullanılan hedefe özgü probun/probların optimizasyonunu ve tasarımını gerektirir.Çeşitli tipte prob tasarımları mevcuttur, ancak en yaygın tip, bir florofor ve söndürücü içeren bir hidroliz probudur.Floresan rezonans enerji transferi (FRET), prob sağlam iken söndürücü yoluyla floroforun emisyonunu önler.Ancak PCR reaksiyonu sırasında prob, bağlı olduğu spesifik dizinin primer uzaması ve amplifikasyonu sırasında hidrolize olur.Probun bölünmesi, floroforu söndürücüden ayırır ve floresansta amplifikasyona bağlı bir artışla sonuçlanır (Şekil 4).Bu nedenle, prob bazlı bir qPCR reaksiyonundan gelen floresans sinyali, numunede mevcut olan prob hedef dizisinin miktarıyla orantılıdır.Prob bazlı qPCR, boya bazlı qPCR'den daha spesifik olduğundan, genellikle qPCR tabanlı teşhis testlerinde kullanılan teknolojidir.

İzotermal Amplifikasyon

Yukarıda bahsedilen PCR teknikleri, denatürasyon, tavlama ve uzatma adımları için oda sıcaklıklarını doğru bir şekilde artırmak ve azaltmak için pahalı ısıl döngü ekipmanı gerektirir.Bu tür hassas cihazlara ihtiyaç duymayan ve basit bir su banyosunda veya hatta ilgili hücrelerin içinde gerçekleştirilebilen bir takım teknikler geliştirilmiştir.Bu teknikler topluca izotermal amplifikasyon olarak adlandırılır ve üstel, doğrusal veya kademeli amplifikasyona dayalı çalışır.

En iyi bilinen izotermal amplifikasyon türü, döngü aracılı izotermal amplifikasyon veya LAMP'tır.LAMP, şablon DNA veya RNA'yı amplifiye etmek için 65⁰C'de üstel amplifikasyonu kullanır.LAMP gerçekleştirilirken, yeni DNA sentezlemek için bir DNA polimeraz ile birlikte hedef DNA'nın bölgelerine tamamlayıcı dört ila altı primer kullanılır.Bu primerlerden ikisi, diğer primerlerdeki dizileri tanıyan ve bunları bağlayan tamamlayıcı dizilere sahiptir; bu, yeni sentezlenen DNA'da daha sonra amplifikasyonun sonraki turlarında primer bağlanmasına yardımcı olan bir "döngü" yapısının oluşmasına izin verir.LAMP, floresans, agaroz jel elektroforezi veya kolorimetri dahil olmak üzere birçok yöntemle görselleştirilebilir.Kolorimetri ile ürünün varlığını veya yokluğunu görselleştirmenin ve tespit etmenin kolaylığı ve gerekli pahalı ekipmanın bulunmaması, LAMP'ı klinik laboratuvar testlerinin kolayca mevcut olmadığı veya numunelerin saklandığı ve nakledildiği alanlarda SARS-CoV-2 testi için uygun bir seçenek haline getirdi. mümkün değildi veya daha önce PCR ısıl döngü ekipmanına sahip olmayan laboratuvarlarda.