PCR reaksiyonunun öne çıkan özelliği, geniş amplifikasyon kapasitesi ve son derece yüksek hassasiyetidir.PCR performansını ve algılama verimliliğini artırmak için PCR amplifikasyon kapasitesini ve algılama hassasiyetini geliştirmeye kararlıyız, ancak baş ağrısı deney sürecindedir.Yanlış pozitifler sıklıkla meydana gelir ve çok az miktarda numune çapraz kontaminasyonu veya PCR ürünü kontaminasyonu deneyde yanlış pozitiflere neden olabilir.
Beş tür PCR ürünü kontaminasyonu
Kabaca aşağıdaki kategorilere ayrılabilen PCR kontaminasyonunun birçok nedeni vardır:
Numune kontaminasyonu esas olarak numunenin toplandığı kabın kontaminasyonundan kaynaklanır veya numune yerleştirildiğinde gevşek sızdırmazlık nedeniyle kaptan dışarı sızar veya numune kabın dışına yapıştırılarak çapraz kontaminasyona neden olur;Kontaminasyon numuneler arasında kontaminasyona yol açar;bazı mikrobiyal örnekler, özellikle virüsler, aerosollerle yayılabilir veya aerosoller oluşturarak karşılıklı kontaminasyona neden olabilir.
Bunun ana nedeni, PCR reaktiflerinin hazırlanması sırasında numune tabancası, kap, çift distile su ve diğer solüsyonların PCR nükleik asit şablonu ile kontamine olmasıdır.
Moleküler biyoloji laboratuvarlarında ve klonlanmış plazmitleri pozitif kontroller olarak kullanan bazı laboratuvarlarda, klonlanmış plazmid kontaminasyonu sorunu da yaygındır.Çünkü birim hacimdeki klonlama plazmidi içeriği oldukça yüksektir ve saflaştırma işleminde daha fazla araç ve reaktife ihtiyaç vardır ve canlı hücrelerdeki plazmitin, canlı hücrelerin güçlü büyüme ve üreme yeteneği nedeniyle kontamine olma olasılığı çok yüksektir.
Çoğaltılmış ürünlerin kontaminasyonu, PCR reaksiyonlarında en yaygın kontaminasyon problemidir.PCR ürününün kopya miktarı büyük olduğundan (genellikle 1013 kopya/ml), PCR saptama kopya sayısı sınırından çok daha yüksektir, çok küçük miktarda PCR ürünü kontaminasyonu yanlış pozitiflere neden olabilir.
Aerosol kirliliği, PCR ürünlerinin en olası kontaminasyon şeklidir ve aynı zamanda gözden kaçırılması en kolay olanıdır.Sıvı yüzeyi ile hava arasındaki sürtünme ile oluşur.Genel olarak, aerosol kontaminasyonu kapak açıldığında, numune aspire edildiğinde veya hatta reaksiyon tüpü kuvvetlice çalkalandığında oluşabilir.Hesaplamalara göre, bir aerosol parçacığı 48.000 kopya içerebilir, bu nedenle neden olduğu kirlilik, özel ilgiyi hak eden bir sorundur.
Özellikle test laboratuvarları belirli bir geni test etmek için genellikle aynı primer çiftini kullanır.Zamanla, laboratuvar alanında büyük miktarda PCR ürünü kontaminasyonu meydana gelecektir.Bu tür bir kirlenme bir kez meydana geldi mi, kısa sürede ortadan kaldırmak zordur.
İlk üç kirlilik türü için, önlemek için etkili yöntemler kullanabiliriz, ancak PCR ürünlerinin neden olduğu kirliliğin önlenmesi, özellikle standart olmayan PCR laboratuvarlarının yapımında zordur.PCR işleminde pipet ucu sıvıyı emip üflediğinde ve PCR tüpünün kapağı açıldığında bir aerosol oluşacaktır.Aerosolün taşıdığı DNA molekülleri (bir aerosol onbinlerce DNA taşıyabilir) havada yüzdükleri için ortadan kaldırılması zordur.PCR deneylerinin bir sonraki turu başlatıldığında, yanlış pozitifler kaçınılmaz olarak ortaya çıkacaktır.
Aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, negatif kontrol ilgili ilgi bandını da yükseltmiştir:
PCR kirliliği ve önleme ile ilgili bu sayının ilk bölümü burada tanıtılmaktadır.Bir sonraki sayıda "PCR ürünü kontaminasyonunun önlenmesi" başlıklı ikinci bölümle karşınızdayız, takipte kalın!
Gönderim zamanı: 25 Temmuz 2017
