İşitme kaybı (HL), insanlarda en sık görülen duyusal engellilik hastalığıdır.Gelişmiş ülkelerde, çocuklarda dil öncesi sağırlık vakalarının yaklaşık %80'i genetik faktörlerden kaynaklanmaktadır.En yaygın olanları tek gen kusurlarıdır (Şekil 1'de gösterildiği gibi), 124 gen mutasyonunun insanlarda sendromik olmayan işitme kaybıyla ilişkili olduğu bulunmuştur, geri kalanına çevresel faktörler neden olur.Bir koklear implant (iç kulağa yerleştirilen ve doğrudan işitme sinirine elektrik stimülasyonu sağlayan bir elektronik cihaz) şiddetli HL'yi tedavi etmek için açık ara en etkili seçenekken, bir işitme cihazı (ses dalgalarını dönüştüren ve yükselten harici bir elektronik cihaz) orta derecede HL'ye sahip Hastalara yardımcı olabilir.Bununla birlikte, şu anda kalıtsal HL'yi (GHL) tedavi edecek herhangi bir ilaç bulunmamaktadır.Son yıllarda, gen terapisi, iç kulak disfonksiyonunu tedavi etmek için umut verici bir yaklaşım olarak artan bir ilgi görmüştür.

Şekil 1.Sağırlıkla ilişkili varyasyon tipinin dağılımı.[1]

Son zamanlarda, Salk Enstitüsü ve Sheffield Üniversitesi'nden bilim adamları, kalıtsal sağırlığın in vivo gen tedavisi için geniş uygulama umutları gösteren Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2]'de bir araştırma sonucu yayınladılar.Salk Enstitüsü'nde yardımcı araştırma profesörü ve Waitt Center for Advanced Biophotonics'in direktörü Uri Manor, doğuştan ciddi işitme kaybıyla doğduğunu ve işitme duyusunu geri kazanmanın harika bir hediye olacağını hissettiğini söyledi.Önceki araştırması, Eps8'in aktin bağlama ve kapatma aktivitelerine sahip bir aktin düzenleyici protein olduğunu buldu;koklear tüylü hücrelerde, Eps8'in MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 ve GNAI3 ile oluşturduğu protein kompleksi, çoğunlukla MYO15A ile birlikte BAIAP2L2'yi daha kısa stereosilyaların uçlarında lokalize eden uzun stereosilyaların uçları, saç demetlerinin bakımı için gereklidir.Bu nedenle Eps8, normal işitme işlevi için gerekli olan tüylü hücrelerin stereocilia uzunluğunu düzenleyebilir;Eps8'in silinmesi veya mutasyonu, kısa stereocilia'ya yol açacaktır, bu da beynin algısı için sesi uygun şekilde elektrik sinyallerine dönüştürememesine neden olur ve bu da sağırlığa yol açar..Aynı zamanda, Sheffield Üniversitesi'nde profesör olan işbirlikçi Walter Marcotti, tüy hücrelerinin Eps8'in yokluğunda normal şekilde gelişemeyeceğini keşfetti.Bu çalışmada Manor ve Marcotti, stereosiliyer hücrelere Eps8 eklenmesinin farelerde işlevlerini geri getirip getirmediğini ve dolayısıyla işitmeyi iyileştirip iyileştirmediğini araştırmak için bir araya geldi.Araştırma ekibi, vahşi tip EPS8 içeren kodlama dizisini yuvarlak pencere zarı enjeksiyonu ile Eps8-/- yeni doğmuş P1-P2 farelerinin kokleasına iletmek için adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü Anc80L65'i kullandı;fare koklear tüylü hücrelerinde stereocilia'nın işlevi olgunlaşmadan onarılmıştır;ve onarım etkisi, görüntüleme teknolojisi ve stereocilia ölçümü ile karakterize edildi.Sonuçlar, Eps8'in düşük frekanslı hücrelerde stereocilia'nın uzunluğunu artırdığını ve tüylü hücre fonksiyonunu eski haline getirdiğini gösterdi.Ayrıca, zamanla hücrelerin bu gen terapisiyle kurtarılma yeteneklerini yitirdiğini de buldular.Bunun anlamı, fareler doğduktan sonra Eps8-/- saç hücreleri olgunlaşmış veya tamir edilemeyecek birikmiş hasara sahip olabileceğinden, bu tedavinin rahim içinde uygulanması gerekebileceğidir.Manor, "Eps8, birçok farklı işleve sahip bir protein ve keşfedilecek daha çok şey var" dedi.Gelecekteki araştırmalar, Eps8 gen terapisinin farklı gelişim aşamalarında işitmeyi geri kazanmadaki etkisini ve tedavi fırsatlarını uzatmanın mümkün olup olmayacağını araştırmayı içerecektir.Tesadüfen, Kasım 2020'de İsrail'deki Tel Aviv Üniversitesi'nden Profesör KarenB Avraham, zararsız sentetik adeno-ilişkili virüs AAV9-PHP yaratmak için yenilikçi bir gen terapisi teknolojisi kullanarak sonuçlarını EMBO Molecular Medicine [3] dergisinde yayınladı.B, Syne4-/- farelerinin tüylü hücrelerindeki gen kusuru, Syne4'ün kodlama dizisini taşıyan bir virüsün farelerin iç kulağına enjekte edilmesiyle onarıldı, tüylü hücrelere girmesine izin verildi ve taşınan genetik materyali serbest bırakarak, bunların olgunlaşmasına ve normal şekilde çalışmasına izin verildi (Şekil 2'deki gibi).

İncir. 2.Corti organına ve nesprin-4'ün hücresel işlevine odaklanan iç kulak anatomisinin şematik gösterimi.

Mutasyona uğramış herhangi bir genin tedavi için sokulması, çıkarılması veya düzeltilmesi (yani hastalıktaki genetik değişikliklerin kontrol edilmesi) yoluyla gen düzeyinde kalıtsal hastalıkların tedavi edilmesi amacına ulaşmak için gen terapisi kullanımının klinik etkisinin yüksek olduğu görülmektedir.uygulama umutları.Genetik olarak yetersiz sağırlık için mevcut gen tedavisi yöntemleri aşağıdaki kategorilere ayrılabilir:

gen değişimi

Gen değişimi, kusurlu bir genin tanımlanması ve genin normal veya vahşi tip bir kopyası ile değiştirilmesine dayanan, tartışmasız en "basit" gen terapisi şeklidir.Vesiküler glutamat taşıyıcı 3 (VGLUT3) geninin silinmesinin neden olduğu işitme kaybı için ilk başarılı iç kulak gen tedavisi çalışması;İç kulak saç hücrelerinde (IHC'ler) eksojen VGLUT3 aşırı ekspresyonunun AAV1 aracılı iletimi, sürekli işitme iyileşmesi, kısmi şerit sinaptik morfoloji iyileşmesi ve konvülsif tepkilerle sonuçlanabilir [4].Bununla birlikte, yukarıdaki girişte açıklanan AAV ile iletilen iki gen değişimini içeren örneklerde, belirli gen silme kalıtsal işitme kaybı bozuklukları türleri için kullanılan fare modellerinin insanlardan geçici olarak farklı olduğunu ve P1 farelerinde iç kulağın gelişimin olgun aşamasında olduğunu not etmek önemlidir.Aksine, insanlar olgun bir iç kulakla doğarlar.Bu fark, olgun fare kulaklarına gen tedavisi uygulanmadığı sürece fare sonuçlarının insan kalıtsal sağırlık bozukluklarının tedavisine uygulanmasını engeller.

Gen Düzenleme: CRISPR/Cas9

"Gen değiştirme" ile karşılaştırıldığında, gen düzenleme teknolojisinin gelişimi, genetik hastalıkları kökten tedavi etmenin şafağını getirdi.Daha da önemlisi, gen düzenleme yöntemi, baskın kalıtsal sağırlık hastalıkları için uygun olmayan geleneksel aşırı ekspresyon gen terapisi yöntemlerinin eksikliklerini ve aşırı ekspresyon yönteminin uzun sürmemesi sorununu giderir.Çinli araştırmacılar, AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 gen düzenleme sistemini kullanarak Myo6WT/C442Y farelerinde Myo6C442Y mutant alelini özel olarak ortadan kaldırdıktan sonra ve nakavttan sonraki 5 ay içinde, fareler Modelin işitsel işlevi geri yüklendi;aynı zamanda iç kulaktaki tüylü hücrelerin hayatta kalma oranlarının iyileştiği, kirpiklerin şeklinin düzenli hale geldiği ve elektrofizyolojik göstergelerin düzeldiği de gözlenmiştir [5].Bu, Myo6 gen mutasyonunun neden olduğu kalıtsal sağırlığın tedavisinde CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanıldığı dünyadaki ilk çalışmadır ve kalıtsal sağırlığın tedavisi için gen düzenleme teknolojisinin önemli bir araştırma ilerlemesidir.Tedavinin klinik çevirisi sağlam bir bilimsel temel sağlar.

Gen tedavisi verme yöntemleri

Gen tedavisinin başarılı olabilmesi için, çıplak DNA moleküllerinin hidrofilik olmaları ve fosfat gruplarının negatif yükleri nedeniyle hücrelere etkili bir şekilde nüfuz edememeleri ve takviye edilen nükleik asit moleküllerinin bütünlüğünün sağlanması için güvenli ve etkili bir yöntemin seçilmesi gerekir.Eklenen DNA, hedef hücreye veya dokuya iletilir.AAV, yüksek enfeksiyöz etkisi, düşük immünojenikliği ve çeşitli doku tiplerine geniş tropizmi nedeniyle hastalık tedavisi için yaygın olarak bir dağıtım aracı olarak kullanılır.Şu anda, geniş bir araştırma grubu, fare kokleasındaki farklı hücre tiplerine göre AAV'nin farklı alt tiplerinin tropizmini belirlemiştir.Hücreye özgü promotörlerle birleştirilmiş AAV dağıtım özelliklerinin kullanılması, hedef dışı etkileri azaltabilen hücreye özgü ifade elde edebilir.Ek olarak, geleneksel AAV vektörlerine bir alternatif olarak, sürekli olarak yeni sentetik AAV vektörleri geliştirilmekte ve iç kulakta üstün iletim yeteneği göstermektedir; bunlardan en yaygın kullanılanı AAV2/Anc80L65'tir.Viral olmayan dağıtım yöntemleri ayrıca fiziksel yöntemlere (mikroenjeksiyon ve elektroporasyon) ve kimyasal yöntemlere (lipit bazlı, polimer bazlı ve altın nanopartiküller) ayrılabilir.Her iki yaklaşım da kalıtsal sağırlık bozukluklarının tedavisinde kullanılmış ve farklı avantajlar ve sınırlamalar göstermiştir.Bir araç olarak gen terapisi için dağıtım aracına ek olarak, farklı hedef hücre tiplerine, uygulama yollarına ve terapötik etkinliğe dayalı olarak in vivo gen uygulaması için farklı yaklaşımlar kullanılabilir.İç kulağın girift yapısı, hedef hücrelere ulaşmayı zorlaştırır ve genom düzenleyici ajanların dağılımı yavaştır.Membran labirent, temporal kemiğin kemik labirenti içinde bulunur ve koklear kanal, semisirküler kanal, utrikül ve balonu içerir.Göreceli izolasyonu, minimal lenfatik dolaşımı ve kan labirenti bariyeri ile kandan ayrılması, terapötiklerin yalnızca yenidoğan farelerine etkili sistemik dağıtımını sınırlar.Gen terapisine uygun viral titreler elde etmek için viral vektörlerin iç kulağa doğrudan lokal enjeksiyonu gereklidir.Yerleşik enjeksiyon yolları şunları içerir [6]: (1) yuvarlak pencere membranı (RWM), (2) trakeostomi, (3) endolenfatik veya perilenfatik kokleostomi, (4) yuvarlak pencere membranı artı Tüp fenestrasyonu (CF) (Şekil 3'teki gibi).

Şek. 3.Gen terapisinin iç kulak iletimi.

Gen terapisinde klinik dönüşüm hedeflerine dayalı birçok ilerleme kaydedilmiş olsa da, özellikle güvenli ve etkili vektörlerin ve dağıtım yönteminin geliştirilmesinde, gen terapisinin genetik hastalıkları olan hastalar için birinci basamak tedavi seçeneği haline gelmesinden önce daha fazla çalışma yapılması gerekiyor.Ancak yakın gelecekte bu tür tedavilerin kişiselleştirilmiş terapinin temeli haline geleceğine ve genetik bozukluğu olan kişilerin ve ailelerinin yaşamları üzerinde son derece olumlu bir etkiye sahip olacağına inanıyoruz.

Foregene ayrıca hedeflenen genler için hızlı olan ve RNA ekstraksiyonu olmadan ters transkripsiyon ve qPCR reaksiyonları gerçekleştirebilen yüksek verimli bir tarama kiti başlattı.

Ürün Bağlantıları

Cell Direct RT-qPCR kiti—Taqman/SYBR GREEN I

Daha fazla ürün bilgisi için lütfen iletişime geçin:

overseas@foregene.com