Kantitatif PCR veya qPCR olarak da bilinen Real Time PCR, PCR amplifikasyon ürünlerinin gerçek zamanlı izlenmesi ve analizi için bir yöntemdir.
Kantitatif PCR, basit çalışma, hızlı ve kullanışlı, yüksek hassasiyet, iyi tekrarlanabilirlik ve düşük kontaminasyon oranı avantajlarına sahip olduğundan, tıbbi testlerde, ilaç etkinliği değerlendirmesinde, gen ekspresyon araştırmalarında, transgenik araştırmalarda, gen tespitinde, patojen tespitinde, hayvan ve bitki tespitinde yaygın olarak kullanılmaktadır., gıda testi ve diğer alanlar.
Bu nedenle, ister yaşam bilimleri alanında temel araştırmalar yapıyor olun, ister ilaç firmaları, hayvancılık firmaları, gıda firmaları çalışanları, hatta giriş-çıkış muayene ve karantina büroları, çevre izleme departmanları, hastaneler ve diğer birimlerin çalışanları olsun, az veya çok maruz kalacağınız Ya da kantitatif PCR'ye hakim olma bilgisini bilmeniz gerekiyor.

Gerçek Zamanlı PCR Prensibi

Real Time PCR, PCR reaksiyon sistemine flüoresan maddelerin eklendiği ve PCR reaksiyonu sürecindeki floresans sinyal yoğunluğunun kantitatif bir PCR cihazı ile gerçek zamanlı olarak izlendiği ve son olarak deneysel verilerin analiz edilerek işlendiği bir yöntemdir.

【Amplifikasyon eğrisi】PCR'nin dinamik sürecini tanımlayan eğridir.PCR'nin amplifikasyon eğrisi aslında standart bir üstel eğri değil, bir sigmoid eğridir.

[Amplifikasyon eğrisinin platform aşaması]PCR döngülerinin sayısının artması, DNA polimerazın etkisizleştirilmesi, dNTP'lerin ve primerlerin tükenmesi ve reaksiyon yan ürünü pirofosfat vb. tarafından sentez reaksiyonunun inhibisyonu ile PCR her zaman üstel olarak genişlemez., ve sonunda bir platoya girecek.

[Amplifikasyon Eğrisinin Üstel Büyüme Bölgesi]Plato fazı büyük ölçüde değişiklik gösterse de, amplifikasyon eğrisinin üstel büyüme bölgesinin belirli bir bölgesinde tekrarlanabilirlik çok iyidir, bu da PCR'nin kantitatif analizi için çok önemlidir.

[Eşik değeri ve Ct değeri]Amplifikasyon eğrisinin üstel büyüme alanındaki uygun konumda, yani eşik değerinde (Eşik) floresan saptama sınır değerini ayarladık.Eşik değeri ile amplifikasyon eğrisinin kesişimi Ct değeridir, yani Ct değeri, eşik değerine ulaşıldığında döngü sayısını (Eşik Döngüsü) ifade eder.

Aşağıdaki grafik, eşik çizgisi ile amplifikasyon eğrisi, eşik ve Ct değeri arasındaki ilişkiyi açıkça göstermektedir.

【Nasıl ölçülür?】

Ct değerinin ilk şablon sayısının logaritması ile ters doğrusal bir ilişkiye sahip olduğu matematiksel teori ile kanıtlanmıştır.Real Time PCR, PCR amplifikasyon ürünlerini gerçek zamanlı olarak izler ve üstel amplifikasyon fazı sırasında bunları ölçer.

Her PCR döngüsü için, DNA katlanarak 2 kat arttı ve kısa süre sonra bir platoya ulaştı.

Başlangıç ​​DNA miktarının A olduğunu varsayarsak₀ , n döngüden sonra, teorik DNA ürünü miktarı şu şekilde ifade edilebilir:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Daha sonra, başlangıçtaki DNA miktarı Ao ne kadar fazla olursa, amplifiye edilen ürünün miktarı saptama değerine An o kadar çabuk ulaşır ve An'a ulaştığı zamanki döngü sayısı Ct değeridir.Yani, başlangıçtaki DNA miktarı Ao ne kadar fazlaysa, amplifikasyon eğrisi o kadar erken zirve yapar ve buna karşılık gelen gerekli döngü sayısı n daha küçüktür.

Bilinen konsantrasyon standardının gradyan seyreltmesini gerçekleştiririz ve bunu Real Time PCR için bir şablon olarak kullanırız ve başlangıç ​​DNA miktarının büyükten küçüğe sırasına göre eşit aralıklarla bir dizi amplifikasyon eğrisi elde edilir.Ct değeri ile başlangıç ​​şablon sayısının logaritması arasındaki doğrusal ilişkiye göre, bir[standart eğri] oluşturulabilir.

Konsantrasyonu bilinmeyen numunenin Ct değerinin standart eğriye ikame edilmesiyle, Real Time PCR'nin kantitatif prensibi olan konsantrasyonu bilinmeyen numunenin başlangıç ​​şablon miktarı elde edilebilir.

Gerçek Zamanlı PCR'nin algılama yöntemi

Real Time PCR, reaksiyon sistemindeki floresans yoğunluğunu tespit ederek PCR amplifikasyon ürünlerini tespit eder.

Floresan Boya Gömme Yönteminin Prensibi】

Floresan boyalarTB Green ® gibi , PCR sistemlerinde çift sarmallı DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlanabilir ve bağlandıktan sonra floresan yayabilir.

Reaksiyon sistemindeki floresan yoğunluğu, PCR döngülerinin artmasıyla katlanarak arttı.Floresans yoğunluğunu tespit ederek, reaksiyon sistemindeki DNA amplifikasyon miktarı gerçek zamanlı olarak izlenebilir ve daha sonra numunedeki başlangıç ​​şablonunun miktarı tersten tahmin edilebilir.

【Floresan prob yönteminin prensibi】

floresan prob5' ucunda bir floresan grubu ve 3' ucunda bir söndürme grubu bulunan ve şablona spesifik olarak bağlanabilen bir nükleik asit dizisidir.Prob sağlam olduğunda, flüorofor tarafından yayılan flüoresan, söndürme grubu tarafından söndürülür ve flüoresan olamaz.Prob ayrıştırıldığında, flüoresan madde ayrışır ve flüoresans yayar.

PCR reaksiyon solüsyonuna bir floresan probu eklenir.Tavlama işlemi sırasında, flüoresan probu, şablonun belirli konumuna bağlanacaktır.Uzatma işlemi sırasında, PCR enziminin 5'→3' ekzonükleaz aktivitesi, şablonla hibridize edilmiş flüoresan probu parçalayabilir ve flüoresan madde, flüoresans yaymak için ayrışabilir.Probun floresan yoğunluğunun reaksiyon sisteminde saptanması ile PCR ürününün amplifikasyon miktarının izlenmesi amacına ulaşılabilir.

【Floresan Saptama Yönteminin Seçimi】

Yüksek homolojiye sahip dizileri ayırt etmek ve SNP tipleme analizi gibi multipleks PCR tespiti yapmak için kullanılıyorsa, floresan prob yönteminin yeri doldurulamaz.
Diğer Real Time PCR deneyleri için basit, kolay ve düşük maliyetli bir floresan kimera yöntemi kullanılabilir.

multipleks PCR yapabilen güçlü özgüllük

eksiklik

Amplifikasyon için yüksek özgüllük gereksinimleri;

multipleks PCR gerçekleştirilemez Spesifik problar tasarlamak gerekir, yüksek maliyet;

bazen prob tasarımı zordur

İlgili ürünler: