PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), 30 yılı aşkın bir geçmişe sahip in-vitro DNA amplifikasyon teknolojilerinden biridir.

PCR teknolojisine 1983 yılında Cetus, ABD'den Kary Mullis öncülük etti. Mullis, 1985 yılında bir PCR patent başvurusunda bulundu ve aynı yıl Bilim üzerine ilk PCR akademik makalesini yayınladı.Mullis, çalışmalarından dolayı 1993 yılında kimya alanında Nobel Ödülü'ne layık görüldü.

PCR'nin Temel Prensipleri

PCR, hedef DNA fragmanlarını bir milyondan fazla çoğaltabilir.Prensip, DNA polimerazın katalizi altındadır, ana iplikçik DNA'yı bir şablon olarak ve spesifik primeri uzatma için başlangıç ​​noktası olarak kullanır.Denatürasyon, tavlama ve uzatma gibi adımlarla in vitro çoğaltılır.Ana iplikçik şablon DNA'sını tamamlayıcı olan kız iplikçik DNA'sının süreci.

Standart PCR işlemi üç adıma ayrılır:

1.Denatürasyon: DNA çift sarmallarını ayırmak için yüksek sıcaklık kullanın.DNA çift sarmalları arasındaki hidrojen bağı yüksek sıcaklıkta (93-98 ℃) kırılır.

2.Tavlama: Çift sarmallı DNA ayrıldıktan sonra, primerin tek sarmallı DNA'ya bağlanabilmesi için sıcaklığı düşürün.

3. Uzama: DNA polimeraz, sıcaklık düşürüldüğünde bağlı primerlerden DNA şeritleri boyunca tamamlayıcı sarmalları sentezlemeye başlar.Uzatma tamamlandığında, bir döngü tamamlanır ve DNA fragmanlarının sayısı iki katına çıkar.

Bu üç adımı 25-35 kez tekrarlayarak, DNA fragmanlarının sayısı katlanarak artacaktır.

PCR'nin yaratıcılığı, farklı hedef genler için farklı primerlerin tasarlanabilmesi ve böylece hedef gen fragmanlarının kısa sürede amplifiye edilebilmesidir.

Şimdiye kadar PCR, sıradan PCR, floresan kantitatif PCR ve dijital PCR olmak üzere üç kategoriye ayrılabilir.

Sıradan PCR'nin ilk nesli

Hedef geni amplifiye etmek için sıradan bir PCR amplifikasyon aleti kullanın ve ardından ürünü saptamak için agaroz jel elektroforezi kullanın, yalnızca kalitatif analiz yapılabilir.

Birinci nesil PCR'nin ana dezavantajları:

1. Spesifik olmayan amplifikasyona ve yanlış pozitif sonuçlara eğilimli.

2. Tespit uzun zaman alır ve işlem külfetlidir.

3. Yalnızca kalitatif test yapılabilir

İkinci nesil Gerçek Zamanlı PCR

qPCR olarak da bilinen Real-Time PCR, reaksiyon sisteminin ilerleyişini gösterebilen flüoresan probları kullanır ve flüoresan sinyallerinin birikmesi yoluyla amplifiye ürünlerin birikimini izler ve flüoresans eğrisi aracılığıyla sonuçları yargılar.Cq değeri ve standart eğri yardımıyla nicelendirilebilir.

qPCR teknolojisi kapalı bir sistemde yürütüldüğü için kontaminasyon olasılığı azalır ve kantitatif tespit için floresan sinyali izlenebilir, bu nedenle klinik uygulamada en yaygın kullanılan ve PCR'de baskın teknoloji haline gelmiştir.

Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR'de kullanılan floresan maddeler şu şekilde ayrılabilir: TaqMan floresan probu, moleküler işaretçiler ve floresan boya.

1)TaqMan floresan probu:

PCR amplifikasyonu sırasında, bir çift primer eklenirken spesifik bir floresan probu eklenir.Prob bir oligonükleotittir ve her iki ucu da bir raportör floresan grubu ve bir söndürücü floresan grubu ile etiketlenmiştir.

Prob sağlam olduğunda, raportör grup tarafından yayılan flüoresan sinyali söndürme grubu tarafından emilir;PCR amplifikasyonu sırasında, Taq enziminin 5'-3' ekzonükleaz aktivitesi probu ayırır ve bozarak raportör floresan grubu ve söndürücü yapar Floresan grup ayrılır, böylece floresan izleme sistemi floresan sinyalini alabilir, yani her DNA sarmalı amplifiye edildiğinde bir floresan molekülü oluşur ve floresan sinyalinin birikimi PCR ürününün oluşumu ile tamamen senkronize olur.

2) SYBR floresan boya:

PCR reaksiyon sisteminde, fazla miktarda SYBR floresan boya eklenir.SYBR floresan boyası, DNA çift ipliğine spesifik olmayan bir şekilde dahil edildikten sonra, bir floresan sinyali yayar.Zincire dahil olmayan SYBR boya molekülü herhangi bir floresan sinyali yaymaz, böylece floresan sinyali sağlar. PCR ürünlerindeki artış, PCR ürünlerindeki artış ile tamamen senkronizedir.SYBR yalnızca çift sarmallı DNA'ya bağlanır, bu nedenle erime eğrisi, PCR reaksiyonunun spesifik olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

3) Moleküler işaret:

Bu, 5 ve 3 uçlarında yaklaşık 8 bazdan oluşan bir saç tokası yapısı oluşturan, kök halkalı çift etiketli bir oligonükleotit probu.Her iki uçtaki nükleik asit sekansları, flüoresan grubun ve söndürme grubunun sıkı olmasına neden olacak şekilde tamamlayıcı şekilde eşleştirilmiştir.Kapatın, floresan üretilmeyecek.

PCR ürünü oluşturulduktan sonra, tavlama işlemi sırasında moleküler işaretçinin orta kısmı spesifik bir DNA dizisi ile eşleştirilir ve floresan gen, söndürücü genden ayrılarak floresans üretilir.

İkinci nesil PCR'nin ana dezavantajları:

Hassasiyet hala eksiktir ve düşük kopyalı numunelerin tespiti hatalıdır.

Arka plan değerinin etkisi vardır ve sonuç girişime karşı hassastır.

Reaksiyon sisteminde PCR inhibitörleri olduğunda, tespit sonuçları girişime karşı hassastır.

Üçüncü nesil dijital PCR

Dijital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR), uç nokta tespiti yoluyla hedef sekansın kopya sayısını hesaplar ve dahili kontroller ve standart eğriler kullanmadan doğru mutlak kantitatif tespit gerçekleştirebilir.

Dijital PCR uç nokta tespitini kullanır ve Ct değerine (döngü eşiği) bağlı değildir, bu nedenle dijital PCR reaksiyonu, amplifikasyon verimliliğinden daha az etkilenir ve PCR reaksiyon inhibitörlerine karşı tolerans, yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik ile iyileştirilir.

Yüksek hassasiyet ve yüksek doğruluk özelliklerinden dolayı, PCR reaksiyon inhibitörleri tarafından kolayca müdahale edilmez ve bir araştırma ve uygulama sıcak noktası haline gelen standart ürünler olmadan gerçek mutlak kantifikasyon elde edebilir.

Reaksiyon ünitesinin farklı formlarına göre mikroakışkan, çip ve damlacık sistemleri olmak üzere üç ana tipe ayrılabilir.

1) Mikroakışkan dijital PCR, mdPCR:

Mikroakışkan teknolojisine dayalı olarak, DNA şablonu ayrılır.Mikroakışkan teknolojisi, numunenin nano-yükseltilmesini veya daha küçük damlacıkların üretilmesini gerçekleştirebilir, ancak damlacıkların özel bir adsorpsiyon yöntemine ihtiyacı vardır ve ardından PCR reaksiyon sistemi ile birleştirilir.mdPCR yavaş yavaş diğer yöntemlerle değiştirilerek benimsenmiştir.

2) Damlacık tabanlı dijital PCR, ddPCR:

Numuneyi damlacıklar halinde işlemek için yağda su damlacık oluşturma teknolojisini kullanın ve nükleik asit molekülleri içeren reaksiyon sistemini, her biri tespit edilecek nükleik asit hedef molekülünü içermeyen veya test edilecek bir ila birkaç nükleik asit hedef molekülü içeren binlerce nano ölçekli damlacığa bölün.

3) Çip tabanlı dijital PCR, cdPCR:

Birçok mikrotüp ve mikroboşluğu silikon gofretler veya kuvars cam üzerine kazımak için entegre sıvı yolu teknolojisini kullanın ve farklı kontrol valfleri yoluyla çözeltinin akışını kontrol edin ve mutlak ölçüm elde etmek için dijital PCR Reaksiyonu için numune sıvısını reaksiyon kuyularında aynı boyutta nanometrelere bölün.

Üçüncü nesil PCR'nin ana dezavantajları:

Ekipman ve reaktifler pahalıdır.

Şablon kalite gereksinimleri yüksektir.Şablon miktarı mikro sistem miktarını aşarsa, ölçmek imkansız olacaktır ve çok küçükse, niceleme doğruluğu azalacaktır.

Spesifik olmayan amplifikasyon olduğunda da yanlış pozitifler üretilebilir.