Herkes qRT-PCR deneyinin prensibinden, primer tasarımından, sonuç yorumlamasından vs bahsediyor ama qRT-PCR'nin deneysel işleyişini sizlerle paylaşmam gerektiğini düşünüyorum.Küçük ama önemli olan sonuçlar.
qRT-PCR yapmadan önce, kendi RNA'mızı ve çalışma yöntemlerimizi net bir şekilde anlamamız gerekir.Ne de olsa, çabalarımız sadece pratik yapmaktan ziyade sonuç almaya yöneliktir.Bu yüzden qRT-PCR yapmadan önce aşağıdaki hususları belirlememiz gerekir (bunlardan bazıları sadece SYBR için geçerlidir).
1 RNA'nızın bozulmadığından emin misiniz?
NanoDrop 2000, yalnızca RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını algılayabilir, ancak RNA'nın bütünlüğünü algılayamaz.
RNA (RNA Yoğunluk Sayısı) değeri, Agilent 2100 Bioanalyzer sistemi tarafından tespit edilen RNA bütünlüğünü yansıtabilir.
Şekil. Farklı RNA numuneleri (ökaryotlar) için RIN değerlerinin şematik diyagramı
Ancak laboratuvarlarda genellikle Agilent 2100 Bioanalyzer bulunmaz.Bu durumda formaldehit jel yoluyla tespit edebiliriz, ancak toplam RNA miktarı gereksinimi yüksektir, bu nedenle en hızlı yöntem sıradan jel elektroforezi kullanmaktır.Nükleaz içermeyen bir ortamda olması gerekir, bu nedenle elektroforez tankı, sol şişesi, jel braketi ve tarağın DEPC suyu ile durulanması gerekir.Agaroz ayrıca nükleaz içermez (yeni açıldığı sürece) ve Yükleme Tamponu %1,2 jel ile mümkün olduğunca yeni açılmalıdır.
Jelin tamamen çözünmesi gerektiğine dikkat edin, aksi halde şekilde örnek 9'da gösterildiği gibi homojen olmayan bantlara neden olur.Voltaj çok yüksekse veya çok uzun süre çalışıyorsa, ısı üretecek ve RNA bozulmasına neden olacaktır, bu nedenle voltaj ve süre makul bir şekilde kontrol edilmelidir.Ek olarak, jel çalıştırma ayrıca numunede DNA kalıntısı olup olmadığını da belirleyebilir ve dağıtım kuyusunda çok sayıda tutulmuş bant olup olmadığını gözlemleyebilir.
Figür.RNA'nın jel elektroforez tespiti
2 cDNA'nızın konsantrasyonundan emin misiniz?
Laboratuvardaki ağabeylerin deneyimi, her inversiyonla elde edilen 20 ul sistemin cDNA'sının doğrudan 20X seyreltilmesi, doktora sonrası kız kardeşlerin ise 10X seyreltilmesidir.Genelde duruma göre değişirim.Her kişinin bahsettiği RNA'nın kalitesi farklı olduğu için tersine çevirme düzeyi de farklıdır ve tersine çevirme teknolojisi kararlı olmayabilir.
Bu nedenle, ters çevrilmiş cDNA'yı her aldığımda, önce onu yaklaşık 3 kez seyrelteceğim ve ardından RT-PCR yapmak için temizlik genini kullanacağım, spesifik konsantrasyonu belirlemek için döngü sayısı genellikle 25 döngüdür ve ardından nihai seyreltme faktörünü belirler.
3 Astarlarınızın kullanımının kolay olduğundan emin misiniz?
qRT-PCR'nin erime eğrisini geçebilir, ancak bu yine de maliyetlidir.Çok parası olmayan laboratuvarlar için, çok fazla primer aldıklarında, bunun tek bir bant olup olmadığını görmek ve primerlerin özgüllüğünü belirlemek için sıradan RT-PCR'yi kullanabilirler.Laboratuvarın para sıkıntısı yoksa, tüm primerlerin özgüllüğü erime eğrisi aracılığıyla bir kez belirlenebilir.
4 Deney koşullarınızın uygun olduğundan emin misiniz?
SYBR güçlü ışıktan korunmalıdır, bu nedenle SYBR reaktifi eklerken tepedeki ışığı kapatmaya çalışın ve tamamlamak için yalnızca loş ışık kullanmanız gerekir.
SYBR'yi 4°C'de saklayın.Kullanımdayken, köpürmeyi önlemek için iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı çevirin ve kuvvetlice vortekslemeyin.
Bazı küçük kız kardeşler örnekleri karıştırma korkusuyla PCR tahtasına işaretler çizmeyi sever ki bu yanlıştır.İşaretçilerinizin flüoresan sinyallerinin toplanmasını etkileme olasılığı çok yüksek olduğundan, genellikle gençlere aşağıda gösterildiği gibi hafızada yardımcı olması için deneysel defterler kullanmalarını tavsiye ederim.
Figür.qRT-PCR örnek yükleme diyagramı
5 Doğru yaptığınızdan emin misiniz?
Eldiven taktığınızdan, eldiven taktığınızdan, eldiven taktığınızdan ve önemli şeyleri üç kez söylediğinizden emin olun.
SYBR'nin ışığa maruz kalmasını azaltmak için kişisel olarak önce aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi bir şablon eklemek istiyorum.Deneyimlere göre, az miktarda şablon eklenmesi örnekleme hatalarına neden olabilir.Bu nedenle, az miktarda şablon eklemenin neden olduğu hatayı en aza indirmek için, genellikle numuneyi tekrar ikiye katlarım ve eklenen H2O2 miktarını azaltmak için numune eklerken miktarı iki katına çıkarırım.
Figür.qRT-PCR yüklemesinin şematik diyagramı
Daha sonra qRT-PCR sistemini aşağıdaki gibi yapılandırın.
Figür.qRT-PCR sistemi hazırlama şeması
NOT: Yapılandırma işleminin buz üzerinde yapılması gerekir.
Numuneyi ekledikten sonra şeffaf sızdırmazlık filmini yapıştırın.Şeffaf sızdırmazlık filminin yüzeyine ellerinizle dokunmamaya çalışın, sadece filmin her iki yanındaki boşluktan çalıştırın.Çünkü parmak izleri floresan sinyallerin toplanmasını da etkileyebilir.Ardından, numunenin duvarda asılı kalmasını önlemek için düşük hızda 10 s hızlı bir şekilde santrifüj yapmak için bir santrifüj kullanın.
İlgili ürünler:
Gönderim Zamanı: 28 Nisan 2023
