RNase, sıklıkla RNA çıkarma deneyleri yapan birçok öğrencinin duymak istemediği hassas bir kelimedir.Tamamen silahlı, son derece toksik reaktifler fenol ve kloroform ile özütlenen RNA bozuldu.barışmadım!!!Bugün ünlü Rnaz'ın kökenine bir göz atalım.

Ribonükleaz (RNaz) veya RNaz, RNA'yı küçük moleküllere hidrolize edebilen bir nükleazdır.RNase, küçük bir molekül proteini olarak, olağandışı bir şekilde stabildir. .Geleneksel yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı buhar sterilizasyonu ve protein inhibitörleri onu tamamen etkisiz hale getiremez.RNaz'ın stabilitesi esas olarak yapıdaki disülfit bağlarından gelir.Örneğin, sığır pankreasının yaygın olarak kullanılan RNaz'ı yalnızca 124 amino asit içerir, ancak 4 disülfid bağı içerir.Kükürt bağı ve disülfit bağı, RNaz'a mükemmel termal kararlılık kazandırır.Ek olarak, rnaz nispeten küçük bir moleküler ağırlığa sahiptir ve birçok durumda orijinal yapısını hızla geri yükleyebilir.

Son derece kararlı olmasının yanı sıra,RNazlar laboratuvarda her yerde bulunur .RNase biyolojik bir savunma mekanizmasıdır.Bir hücre için eksojen RNA genellikle ölümcüldür.Eksojen DNA ile karşılaştırıldığında, eksojen RNA genellikle daha tehlikelidir.RNA mutlu bir şekilde kopyalanır ve çevrilir, bu nedenle neredeyse tüm organizmalar, eksojen RNA'nın istilasına karşı savunmak için RNazlar geliştirmiştir.Bu nedenle, laboratuvarda yetiştirilen bakteri hücreleri ve RNA'yı çıkaran siz, RNaz aromasını yayıyorsunuz.İnsan vücut sıvıları (tükürük, gözyaşı vb.) büyük miktarda RNaz içerir, bu nedenle RNA bozunduğunda ağlamayın.Ne kadar çok ağlarsanız, RNA bozulması o kadar kötü olur!!Rahibe Daiyu, RNA ekstraksiyonu için uygun değil!

Ek olarak, hassas cildiniz de çok miktarda RNaz içerir ve derinin temas ettiği işaretleyiciler, pipetler, buzdolabı kapıları ve kapı kolları da RNaz içerir.

Bu kadar saçmalamadan sonra, RNase'lerle nasıl başa çıkılacağına bir göz atalım.

RNA'yı çıkarırken herkesin aklına gelen ilk şeyDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC esas olarak proteini, RNaz aktif grubu histidinin imidazol halkası ile birleşerek denatüre eder, böylece enzimin aktivitesini inhibe eder.% 0,1 DEPC, Rnaz üzerinde daha iyi bir giderici etkiye sahip olabilir, ancak DEPC'nin bilinen bir kanserojen olduğuna dikkat etmeliyiz, bu nedenle kullanırken özel dikkat gösterilmelidir.

RNase için iki açıdan başlamamız gerekiyor,ilki, endojen RNaz aktivitesini inhibe etmektir

Trizol'de bulunan guanidin izotiyosiyanat ve DTT gibi geleneksel RNA ekstraksiyon reaktifleri, RNaz'ın disülfit bağını açabilir, ancak özellikle doku örneklerinde hala bazı RNazlar vardır, bu nedenle düşük sıcaklığa dikkat edin.

1.Doku örneğini çıkardıktan hemen sonra sıvı nitrojene veya ticari bir RNA koruma solüsyonuna daldırın.

2.Hücre örneğinin RNA'sını çıkardıktan sonra, bunu lizis solüsyonuna ekleyin ve buz kutusu üzerinde parçalayın.

3. Öğütme için sıvı nitrojen kullanmak en iyisidir doku örnekleri homojenize edildiğinde.Sıvı nitrojen içermeyen bir elektrikli homojenizatör kullanırken, homojenat adaptörünün tamamen önceden soğutulmasına dikkat edin.

İkincisi, eksojen DNase'dir.

1.Tamamen silahlanın, bir laboratuvar önlüğü giyin, bir maske takın ve bir çift yeni eldiven giydiğinizden emin olun (bu kadar tutumlu olmayın!! Trizol'ün süper aşındırıcı olduğu ve ayrıca eldivenlerle çok güçlü olduğu unutulmamalıdır, bu nedenle ellerinize damlatmayın).

2.Kullanılan tüm pipet uçları, EP tüpleri, PCR tüpleri ve diğer ekipmanlar de-RNase işleminden geçirilmelidir.%0,1 DEPC'ye batırılabilir ve daha sonra yüksek basınç altında basınçlandırılabilir.Çeker ocakta çalışmaya dikkat edin.Yerel tiranlar, enzimleri ortadan kaldırmak için doğrudan sarf malzemeleri satın alabilirler.

Not: Size tembel bir yöntem anlatayım.Yüksek sıcaklık ve yüksek basınç, RNaz'ı tamamen ortadan kaldıramasa da, büyük bir bölümünü giderecektir.2 kat yüksek sıcaklık ve yüksek basınç iyi bir etkiye sahiptir ve RNA ekstraksiyonunun çok az etkisi vardır.

3.Alkol proteinleri denatüre edebilir,böylece RNA ekstraksiyon tablosu %75 alkolle silinebilir ve eldivenlere alkol de püskürtülebilir.

4.Nihai RNA çözme solüsyonu ve santrifüj tüpü de RNaz'dan arındırılmalıdır.DEPC su, yaygın olarak kullanılan bir RNA çözme çözeltisidir.DEPC suyunun doğru hazırlama yönteminden bahsedelim (ticari DEPC'yi satın alırken yeniden paketlemeyi unutmayın)

1:1000 oranında ultra saf suya DEPC ekleyin, iyice çalkalayın, 37°C'de bir gece bekletin ve 121°C'de yüksek sıcaklık ve yüksek basınç altında 15 dakika sterilize edin.DEPC suyu -20°C'de 1 ml'lik parçalar halinde saklanabilir.

Son olarak, özetlemek gerekirse: anahtar düşük sıcaklıktır, sarf malzemeleri iyi işlenir, tamamen silahlanır ve daha az konuşulur!

Bugünün stratejisi bu kadar.Size bahsettiğiniz tüm RNA konsantrasyonunu ve saflığını diliyorum.A260/A280'in her ikisi de 2.0'dır!!!

tabi eğer kullanırsanoda sıcaklığında çalışma RNA ekstraksiyon kiti, yukarıdaki sıkıntılarla karşılaşmayabilirsiniz.

Oda sıcaklığında, DNase eklenmeden çalışma, hücrelerden toplam RNA'yı 11 dakikada ve hayvan dokularından veya bitkilerden toplam RNA'yı 30 dakikada çıkarır.

Deneme numuneleri için lütfen iletişime geçin:overseas@foregene.com

İlgili ürünler:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/