RT-qPCR deneyi, RNA ekstraksiyonu ve kalite değerlendirmesi, ters transkripsiyon ve qPCR üç adımını içerir, her adımın birçok önlemi vardır, aşağıda ayrıntılı olarak tanıtacağız.

Ⅰ.RNA kalite değerlendirmesi

RT-qPCR deneyinde, RNA ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, RNA'nın kalitesinin değerlendirilmesi gerekir ve takip deneyi ancak kalifiye olduktan sonra gerçekleştirilebilir.Değerlendirme yöntemleri arasında spektrofotometre, Agilent jel elektroforezi, Agilent 2100 analizi yer almakta olup bunların arasında en sık kullanılan spektrofotometre ve agaroz jel elektroforez yöntemi saptamadır.RNA kalitesinin sağlanması amacıyla, RNA konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün saptanması ve analizini tamamlamak için bu iki yöntemin birlikte kullanılması gerektiğine dikkat edilmelidir.

İlgili RNA İzolasyon Kiti: 

Hücre Toplam RNA İzolasyon Kiti

Yüksek düzeyde saflaştırılmış ve yüksek kaliteli toplam RNA, 11 dakikada çeşitli kültürlenmiş hücrelerden elde edilebilir.

Hayvan Total RNA İzolasyon Kiti

Çeşitli hayvan dokularından yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli toplam RNA'yı hızlı ve verimli bir şekilde çıkarın.

Spektrofotometre:

Spektrofotometre esas olarak RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için kullanılır, ancak RNA ve genomik kalıntının bütünlüğünü tespit edemez.Bunların arasında A260/280 ve A260/230, RNA saflık tespiti için önemli parametrelerdir ve değerlerinin dalgalanmasına göre RNA saflığı tespit edilebilir:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA saflığının iyi olduğunu gösterir;A260/280<1.9, RNA'da protein kalıntısı olabileceğini belirtir;A260/280>2.1, agaroz jel elektroforezi ile daha da doğrulanabilen RNA'nın olası kısmi bozulmasını gösterir.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA saflığının iyi olduğunu gösterir;A260/230< 2.0, RNA'da fenoller, etanol veya şekerler gibi organik reaktif kalıntıları olabileceğini gösterir.

Agaroz jel elektroforezi:

Agaroz jel elektroforez testi, RNA bütünlüğünü, genomu ve protein kalıntılarını analiz edebilir, ancak RNA konsantrasyonunu doğru bir şekilde ölçemez veya organik reaktiflerin kalıntılarını tespit edemez.Örneğin ökaryotik RNA şablonlarını ele alalım:

1. RNA, agaroz jel elektroforezine tabi tutuldu.Jel haritasında yalnızca üç tekli 28sRNA, 18sRNA ve 5.8sRNA bandı varsa, bu, ekstrakte edilen RNA'nın sağlam olduğunu gösterir.Sürüklenen bir fenomen varsa, bu RNA'nın kısmi bozulmasını gösterir.

2. Tutkal deliği ile 28sRNA bandı arasında tek bir parlak bant varsa, genomik DNA kalıntısı olabilir.

3. Tutkal deliğinde bantlar görünüyorsa, bu, protein ve diğer makromoleküler maddelerin kalıntıları olabileceğini gösterir.

Ⅱ. Ters transkripsiyon

RNA ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, sonraki deneyler için cDNA'ya ters çevrilmesi gerekir, bu nedenle ters çevirme adımı önemlidir.Ters transkripsiyon, ters transkriptaz ve primer seçiminden tanıtılacaktır:

Ters transkriptaz seçimi:

Tipik ters transkriptazlar, AMV RTaz ve MMLV RTaz'ı içerir.AMV RTase'in RNase H'si güçlü aktiviteye, kısa sentez uzunluğuna, düşük sentez miktarına ve iyi termal kararlılığa (42 ~ 55 ℃) sahiptir.MMLV RTaz'ın RNase H aktivitesi zayıftır, sentez uzunluğu uzundur, sentez miktarı yüksektir ve termal stabilite zayıftır (37 ~ 42 ℃).

RNase H enzimi, RNA şablonunu parçalama işlevine sahip olduğundan, ters transkripsiyon sırasında tercihen zayıf RNase H aktivitesine sahip MMLV seçilmelidir ve daha sonraki genetik mühendislikten sonra, MMLV'nin termal stabilitesi niteliksel bir sıçramaya ulaşmıştır.Foregene almakForeasy Ters Transkriptaz (ters transkripsiyon için M-MLV) örnek olarak, genetik rekombinasyon teknolojisi kullanılarak E. coli tarafından tasarlanmış bakterilerde ifade edilen yeni bir ters transkriptazdır.Tek sarmallı RNA, DNA veya bir RNA:DNA hibritinden tamamlayıcı bir DNA dizisini sentezleyen bir rekombinant DNA polimerazdır.RNase H aktivitesi, güçlü stabilitesi, güçlü RNA afinitesi ve yüksek tespit hassasiyeti yoktur.

 

Foreasy Ters Transkriptaz (ters transkripsiyon için M-MLV)

Astar seçimi:

Genel olarak RT primerleri üç kategoriye ayrılır: oligo dT, rastgele primerler ve gene özgü primerler.Farklı deneysel gereksinimlere göre kullanım için uygun astarları seçin.

1. Şablon ökaryotik kökenliyse ve rutin PCR amplifikasyonu için geç cDNA kullanılıyorsa, Oligo (dT) önerilir;Sonraki deney yalnızca qPCR için kullanılıyorsa, ters transkripsiyonun etkinliğini artırmak için Oligo'nun (dT) rastgele primerlerle karıştırılması önerilir.

2. Şablon prokaryotlardan ise, ters transkripsiyon için Rastgele Primerler veya gene spesifik primerler seçilmelidir.

Ⅲ.qPCR

Floresan ölçümü, esas olarak kantitatif yöntemlerin seçimi, primer tasarım ilkeleri, ROX seçimi, reaksiyon sistemi konfigürasyonu ve reaksiyon koşulları ayarı vb.

Kantitatif yöntemlerin seçimi:

Nicel yöntemler göreli nicel yöntemlere ve mutlak nicel yöntemlere ayrılır.Göreceli ölçüm, belirli tedavi yöntemlerinin gen ifadesi üzerindeki etkisini saptamak, farklı zamanlarda gen ifadesi farkını saptamak ve farklı dokulardaki gen ifadesi farkını karşılaştırmak için kullanılabilir.Mutlak ölçüm, virüsteki nükleik asit miktarını vb. saptayabilir.Deney yaparken kendi deneylerimize göre uygun kantitatif yöntemleri seçmeliyiz.

Astar tasarım ilkeleri:

qPCR için primer tasarımı, amplifikasyon verimliliği ve ürün özgüllüğü ile doğrudan ilişkilidir.Bu nedenle, iyi primerleri doğru şekilde tasarlamak, başarılı qPCR'nin ilk adımıdır.Astar tasarımında, geleneksel astar tasarımı ilkesi yerine getirilirken aşağıdaki ilkelere dikkat edilmelidir:

1. Hedef parçanın uzunluğu 100 ile 300 bp arasında kontrol edilir;

2. Genomik DNA'nın etkisini önlemek için çapraz ekzon tasarımı;

3. Tasarlanan primerlerin amplifikasyon verimliliği açısından test edilmesi gerekir ve yalnızca amplifikasyon verimliliği standarda (%90-110) ulaştığında kantitatif deneyler için kullanılabilirler;

4. Primer konsantrasyonu genellikle 0,1 uM ile 1,0 uM arasında optimize edilir.

Seçimi-

Kantitatif reaksiyon sürecinde ROX, optik yol farkını, pipetleme hatasını veya buharlaşma ve yoğuşmanın neden olduğu hacim farkını eşit şekilde ayarlayarak sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.Ancak, ROX seçiminin enstrümanla ilgili olduğu unutulmamalıdır.qPCR aleti delikler arasındaki farkı otomatik olarak düzeltme işlevine sahipse, ROX eklemesine gerek yoktur;aksi takdirde, ROX düzeltmesi eklemesi gerekir.Reaktif satın alırken küçük ortaklar, doğru ROX'u seçmek için kullanılan enstrümana göre olmalı, daha sonra hatalardan kaçınmalıdır.

Reaksiyon sisteminin hazırlanması:

20ul ve 50ul reaksiyon hacimleri tercih edilir.Sistem oluşturulurken aşağıdaki hususlara dikkat edilmelidir:

1. Reaksiyon sisteminin ultra temiz çalışma tezgahında havalandırma ile hazırlanması gerekiyor, yeni ddH₂O, her deney için kullanılır;

2. Sistemde kirlilik olup olmadığını doğrulamak için her deneyin NTC hazırlaması gerekir ve sistemi hazırlarken her primer çiftinin NTC yapması gerekir;

3. RNA şablonunda gDNA kalıntısı olup olmadığını saptamak için, saptama için her örnek için NRT hazırlanabilir;

4. Sistem hazırlanırken bir numune için en az 3 teknik tekrar yapılması tavsiye edilir;

5. Şablon cDNA olduğunda, ters transkripsiyon sisteminin qPCR deneyi üzerindeki inhibisyon etkisini azaltmak için 5-10 kat seyreltilmesi önerilir.CT değerinin 20-30 arasına düşmesi için şablon miktarını kademeli olarak keşfetmek daha iyidir;

6. Gerekli reaksiyon sayısını belirleyin, reaksiyon sayısına göre %5-10 artırın ve hacim konfigürasyon sayısını hesaplayın;

7, sistem ön karıştırma prensibi kullanılarak hazırlanır, santrifüjlemeden sonra karıştırılır ve kabarcık oluşmaz;

8, Destekleyici sarf malzemelerini seçmek için mümkün olduğunca.

İlgili RT-qPCR Kiti