algılama özgüllüğü

Çoğu durumda, primer tasarımının amacı, PCR'nin özgüllüğünü en üst düzeye çıkarmaktır.Bu, birçok değişkenin az ya da çok tahmin edilebilir etkisi ile belirlenir.Önemli bir değişken, primerin 3' ucundaki dizidir.

Daha da önemlisi, özgüllük için tasarlanan PCR testlerinin geniş bir dinamik aralıkta yüksek etkinliği sürdürmesi daha olasıdır çünkü test spesifik olmayan amplifikasyon ürünleri üretmez, dolayısıyla PCR reaktifleri ile rekabet eder veya ana amplifikasyon reaksiyonunu inhibe eder.

Tabii ki, bazı durumlarda özgüllük en önemli şey değildir, örneğin amaç yakından ilişkili ancak farklı patojenleri ölçmek olduğunda, özel tasarım, optimizasyon ve doğrulama standartları gereklidir.

Erime eğrisi, en azından tek bir hedefi amplifiye edip etmeme açısından amplikonların özgüllüğünü değerlendirmek için standart bir yöntemdir.Bununla birlikte, erime eğrilerinin yanıltıcı olabileceği vurgulanmalıdır çünkü örneğin yetersiz primerler ve düşük şablon konsantrasyonlarının birleşik etkilerinden etkilenebilirler.

P5 |Erime eğrisi, iki hedef DNA'nın farklı miktarlarının iki tespitinden elde edilen Tm kaymalarını gösterir.

A. Daha yüksek konsantrasyonlarda (ad)), qPCR ölçümü tamamlandıktan sonra belirgin bir primer dimer yoktur.Şablon konsantrasyonu 50 kopyaya (e) düştüğünde, spesifik olmayan bir ürün ortaya çıkmaya başlar ve en düşük konsantrasyondaki (f) tek ürün haline gelir.

B. Test, tüm hedef konsantrasyonlarda aynı Tms'yi kaydetti ve en düşük konsantrasyonda bile (5 kopya) belirgin bir primer dimer yoktu.Bu iki tespit yöntemini kullanırken, NTC'lerde hiçbir amplifikasyon ürünü tespit edilmedi.

P5, şablonun farklı konsantrasyonlarda bulunduğu numunelerle elde edilen çözünme eğrilerini gösterir.P 5a, en düşük iki konsantrasyonda, üretilen spesifik olmayan amplifikasyon ürünlerinin Tms'lerinin spesifik amplikonlarınkinden daha düşük olduğunu gösterir.

Açıkçası, bu tespit yöntemi, düşük konsantrasyonlarda bulunan hedefleri tespit etmek için güvenilir bir şekilde kullanılamaz.

İlginç bir şekilde, NTC'ler, yani hiç DNA'sı olmayan numuneler (spesifik olmayan) amplifikasyon ürünlerini kaydetmedi, bu da arka plan genomik DNA'sının spesifik olmayan amplifikasyon/polimerizasyona katılabileceğini gösterir.

Bazen bu tür arka plan primerleri ve spesifik olmayan amplifikasyon düzeltilemez, ancak genellikle herhangi bir şablon konsantrasyonunda ve NTC'de spesifik olmayan amplifikasyona sahip olmayan bir tespit yöntemi tasarlamak mümkündür (P 5b).

Burada, Cq 35 ile hedef konsantrasyonun amplifikasyonunun kaydedilmesi bile belirli bir çözünme eğrisi üretecektir.Benzer şekilde, NTC'ler spesifik olmayan amplifikasyon belirtileri göstermedi.Bazen tespit davranışı ana liköre bağlı olabilir ve farklı Mg2+ konsantrasyonları ile ilişkili olabilen belirli tampon bileşimlerinde yalnızca spesifik olmayan amplifikasyon tespit edilir.

Algılama kararlılığı

Ta'nın optimizasyonu, qPCR tespitinin ampirik doğrulama ve optimizasyon sürecinde faydalı bir adımdır.NTC'yi yükseltmeden en düşük Cq'yi üreten sıcaklığı (veya sıcaklık aralığını) göstererek primer setinin sağlamlığının doğrudan bir göstergesini sağlar.

Hassasiyetteki iki ila dört kat fark, yüksek mRNA ekspresyonu olan kişiler için önemli olmayabilir, ancak teşhis testleri için pozitif ve yanlış negatif sonuçlar arasındaki fark anlamına gelebilir.

qPCR primerlerinin Ta özellikleri büyük ölçüde değişebilir.Bazı testler çok sağlam değildir ve primerlerin optimal Ta değerinin altında yapılmazlarsa hızla çökerler.

Bu önemlidir, çünkü bu tür bir algılama gerçek dünyada genellikle sorunludur ve numunenin saflığı, DNA konsantrasyonu veya diğer DNA'nın varlığı optimal olmayabilir.

Ayrıca hedef kopya sayısı geniş bir aralıkta değişebilir ve reaktifler, plastik gereçler veya aletler testi kurarken kullanılanlardan farklı olabilir.

P6|Sıcaklık gradyanı, PCR tespitinin farklı sağlamlığını gösterir.

A. İnsan beyni RNA'sından hazırlanan cDNA üzerinde PCR gerçekleştirmek için Bioline'ın Sensifast SYBR ana karışımını (katalog numarası BIO-98050) kullanın.

B. Apalenin amplifikasyon haritasını ve çözünme eğrisini kaydetmek için Bio-Rad'ın CFX qPCR cihazını kullanın (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATTCCCTAGG).

C. ACSBG1'in amplifikasyon grafiği ve erime eğrisi (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP'nin büyütme grafiği ve çözünme eğrisi (NM_0020555.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Farklı tavlama sıcaklıklarında kaydedilen Cq'ler, 7C'lik bir sıcaklık gradyanı altında kaydedilen Cq'deki farkı gösterir.

P 6, istenmeyen bir testin tipik bir sonucunu gösterir; burada qPCR, 59C ile 67C (P 6a) arasında bir Tas gradyanı kullanılarak, üç insan beynine özgü gen için primerler kullanılarak gerçekleştirildi.

Amplifikasyon grafiğinden, Opalin primerlerinin ideal olmaktan uzak olduğu görülebilir, çünkü optimal Ta aralıkları çok dardır (Şekil 6b), yani Cq'ler geniş çapta dağılmıştır, bu da Cq'lerin optimal Cq'leri Düşük ile önemli ölçüde karşılaştırılmasına neden olur.

Bu algılama yöntemi kararsızdır ve yetersiz amplifikasyona yol açabilir.Bu nedenle, bu primer çifti yeniden tasarlanmalıdır.Ek olarak, erime eğrisi analizi (iç metin), her bir Ta'nın erime eğrisi farklı olduğundan, bu tespit yönteminin özgüllüğünün de sorunlu olabileceğini göstermektedir.

P 6c'de gösterilen ACSBG1 tespit yöntemi, yukarıdaki Opalin tespit yönteminden daha sağlamdır, ancak yine de ideal olmaktan uzaktır ve geliştirilebilir olması muhtemeldir.

Bununla birlikte, sağlamlık ve özgüllük arasında gerekli bir bağlantı olmadığını vurguluyoruz, çünkü bu saptama yöntemi tarafından üretilen çözünme eğrisi tüm Tas'ta (iç metin) aynı tepe değerini gösteriyor.

Öte yandan sağlamlık testi, P 6d'de gösterilen GFAP testinde olduğu gibi, geniş bir Tas aralığında benzer Cq'ler üreterek çok daha toleranslıdır.

Aynı 8 santigrat derece aralığında elde edilen Cqs farkı 1'den azdır ve çözünme eğrisi (ek), bu sıcaklık aralığında algılama özelliklerini doğrular.Hesaplanan Tas ile gerçek Ta aralığının çok farklı olabileceğini belirtmekte fayda var.

Araştırmacıların verimli primerler tasarlamasına yardımcı olmak için tasarlanmış birçok kılavuz vardır, bunların çoğu köklü kurallara dayanmaktadır ve primerlerin 3' ucuna çok dikkat edilmiştir.Genellikle 3' ucuna bir G veya C ve iki G veya C tabanı (GC kelepçesi) dahil edilmesi önerilir, ancak son 5 tabanın ikisinden fazla olmamalıdır.

Uygulamada, bu kurallar araştırmacılara rehberlik edebilir, ancak her koşulda doğru olmaları gerekmez.

P7 |Primerin 3' ucunun özgüllük veya etkinlik üzerinde çok az etkisi vardır.

A. İnsan HIF-la (NM_181054.2) geni için primerlerin konumu.

B. Altı test öğesini güçlendirmek için Agilent Brilliant III SYBR Green ana likörü (Kat. No. 600882) kullanın.

C. Bio-Rad'ın CFX qPCR cihazı ve 3′end primerleri tarafından kaydedilen amplifikasyon grafiği ve erime eğrisi.NTC'ler kırmızı ile gösterilmiştir.

D. Her test öğesinin Cqs kaydı

Örneğin, P 7'deki sonuç 3′end kuralıyla çelişir.NTC'de spesifik olmayan amplifikasyona yol açan sadece iki primer kombinasyonu ile tüm tasarımlar temel olarak aynı sonuçları üretir.

Ancak, GC klibinin etkisini destekleyemiyoruz çünkü bu durumda A veya T'yi maksimum 30 baz olarak kullanmak özgüllüğü azaltmaz.

F primerinin GGCC'de sona erdiği Test C, NTC'lerde Cq'leri kaydetti, bu da kişinin 30-ucunda bu dizilerden kaçınmak isteyebileceğini gösterdi.Bir primer çiftinin en iyi 3′uç dizisini belirlemenin tek yolunun, bazı aday primerleri deneysel olarak değerlendirmek olduğunu vurguluyoruz.

Amplifikasyon verimliliği

Daha da önemlisi, spesifik olmayan PCR saptaması hiçbir zaman spesifik olamasa da amplifikasyon verimliliği enzim, ana likör, katkı maddeleri ve döngü koşulları değiştirilerek birçok farklı şekilde ayarlanabilir ve maksimize edilebilir.

PCR tespitinin etkinliğini değerlendirmek için, hedef nükleik asidin 10 veya 5 katı seri seyreltme, yani “standart eğri yöntemi” kullanmak en iyisidir.

Standart bir eğri oluşturmak için PCR amplikonları veya sentetik DNA hedefleri kullanılıyorsa, bu hedeflerin seri dilüsyonları sabit miktarda arka plan DNA (genomik DNA gibi) ile karıştırılmalıdır.

P8 |PCR'nin etkinliğini değerlendirmek için dilüsyon eğrisi.

A. PCR ve erime eğrisi koşulları için HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ve R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ve Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalog numarası 600882) için primerler kullanın.

B. 100 ng RNA ters kopyalandı, 2 kez seyreltildi ve seri olarak seyreltilmiş cDNA numuneleri 5 kez 1 ng insan genomik DNA'sına seyreltildi.Erime eğrisi ekte gösterilmiştir.

C. RT reaksiyonu, seyreltme ve seri seyreltme, ikinci cDNA numunesi için tekrarlandı ve sonuçlar benzerdi.

P 8, iki farklı cDNA örneğinde aynı algılama yöntemini kullanarak iki standart eğri gösterir, sonuç aynı verimliliktir, yaklaşık %100'dür ve R2 değeri de benzerdir, yani deneysel veriler ile regresyon çizgisi veya veriler arasındaki uyum derecesi Doğrusallık derecesi.

İki standart eğri karşılaştırılabilir, ancak tam olarak aynı değildir.Amaç, hedefi doğru bir şekilde ölçmekse, belirsizliği açıklamadan bir kopya numarası hesaplaması sağlamanın kabul edilemez olduğuna dikkat edilmelidir.

P9 |Standart bir eğri kullanarak niceleme ile ilişkili ölçüm belirsizliği.

A. PCR ve erime eğrisi koşullarını gerçekleştirmek için GAPDH (NM_002046) için primerler kullanın.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ve R: TAACTGGTTGAGCACAGG ve Bioline'ın Sensifast SYBR ana karışımı (katalog numarası BIO-98050).

B. Bio-Rad'ın CFX qPCR cihazı ile kaydedilen amplifikasyon tablosu, erime eğrisi ve standart eğri.

C. Standart eğri grafiği ve %95 güven aralığı (CI).

D. Seyreltme eğrisinden türetilen üç Cq değerinin kopya sayısı ve %95 güven aralığı.

P 9, optimize edilmiş bir test için, tek bir standart eğrinin doğal değişkenliğinin yaklaşık 2 kat (%95 güven aralığı, minimumdan maksimuma) olduğunu gösterir, bu beklenebilecek en küçük değişkenlik olabilir.

İlgili ürün:

Hücre Doğrudan RT qPCR Kiti

Fare Kuyruğu Doğrudan PCR kiti

Hayvan Dokusu Doğrudan PCR kiti