Başlangıç materyali: RNA
Kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR), başlangıç materyali olarak RNA'nın kullanıldığı PCR deneylerinde kullanılan deneysel bir yöntemdir.Bu yöntemde, toplam RNA veya haberci RNA (mRNA) önce ters transkriptaz ile tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) kopyalanır.Ardından, şablon olarak cDNA kullanılarak bir qPCR reaksiyonu gerçekleştirildi.RT-qPCR, gen ekspresyonu analizi, RNA girişim doğrulaması, mikrodizi doğrulaması, patojen tespiti, genetik test ve hastalık araştırması dahil olmak üzere çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında kullanılmıştır.
RT-qPCR için bir adım ve iki adım yöntemleri
RT-qPCR, tek adımlı veya iki adımlı bir yöntemle gerçekleştirilebilir.Tek adımlı RT-qPCR, ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonunu birleştirerek, ters transkriptaz ve DNA polimerazın reaksiyonu aynı tampon koşulları altında aynı tüpte tamamlamasını sağlar.Tek adımlı RT-qPCR, yalnızca diziye özgü primerlerin kullanılmasını gerektirir.İki aşamalı RT-qPCR'de ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu, farklı optimize edilmiş tamponlar, reaksiyon koşulları ve primer tasarım stratejileri kullanılarak iki tüpte gerçekleştirilir.
| avantaj | dezavantaj | |
| Bir adım | Her iki reaksiyon da bir tüpte yapıldığından, bu yöntem daha az deneysel hataya sahiptir.
Daha az pipetleme adımı kontaminasyon riskini azaltır
Yüksek verimli amplifikasyon/tarama için uygun, hızlı ve tekrarlanabilir | İki aşamalı reaksiyonlar ayrı ayrı optimize edilemez
İki aşamalı reaksiyon birleştirilerek reaksiyon koşulları tehlikeye atıldığından, hassasiyet iki aşamalı yönteminki kadar iyi değildir.
Tek bir numune tarafından tespit edilen hedeflerin sayısı azdır |
| İki adım | Uzun süre saklanabilen ve çoklu reaksiyonlarda kullanılabilen kararlı cDNA kütüphaneleri oluşturma yeteneği
Hedef genler ve referans genler, birden çok cDNA kitaplığına ihtiyaç duymadan aynı cDNA kitaplığından çoğaltılabilir.
Tekli reaksiyon çalışmalarının optimizasyonunu sağlayan reaksiyon tamponları ve reaksiyon koşulları
Tetikleme koşullarının esnek seçimi | Birden fazla tüp kullanmak ve daha fazla pipetleme adımı DNA kontaminasyonu riskini artırır, ve zaman alıcı.
Tek adımlı yöntemden daha fazla optimizasyon gerektirir |
İlgili ürünler:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Tek Adım)-SYBR Yeşil I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Tek Adım)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Birinci Dizi CDNA Sentezi İçin Ana Premiks
Gerçek Zamanlı PCR Easyᵀᴹ-SYBR Yeşil I Kiti
Gerçek Zamanlı PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Toplam RNA ve mRNA'nın seçimi
Bir RT-qPCR deneyi tasarlarken, ters transkripsiyon için bir şablon olarak toplam RNA'nın mı yoksa saflaştırılmış mRNA'nın mı kullanılacağına karar vermek önemlidir.mRNA biraz daha yüksek hassasiyet sağlayabilse de, toplam RNA hala sıklıkla kullanılmaktadır.Bunun nedeni total RNA'nın başlangıç materyali olarak mRNA'ya göre daha önemli bir avantaja sahip olmasıdır.İlk olarak, süreç, şablonun daha iyi kantitatif olarak geri kazanılmasını ve sonuçların başlangıç hücre sayılarına göre daha iyi normalleştirilmesini sağlayan daha az saflaştırma adımı gerektirir.İkincisi, farklı mRNA'ların farklı geri kazanımlarından kaynaklanan çarpık sonuçların olasılığını önleyebilen mRNA zenginleştirme adımını önler.Genel olarak, çoğu uygulamada hedef genin nispi ölçümü saptamanın mutlak hassasiyetinden daha önemli olduğundan, çoğu durumda toplam RNA daha uygundur.
Ters transkripsiyon astarı
İki adımlı yöntemde, cDNA reaksiyonunu başlatmak için üç farklı yöntem kullanılabilir: oligo(dT) primerleri, rastgele primerler veya sekansa özgü primerler.Tipik olarak, oligo(dT) primerleri ve rastgele primerler kombinasyon halinde kullanılır.Bu primerler şablon mRNA sarmalına bağlanır ve sentez için bir başlangıç noktası olan ters transkriptaz sağlar.
| Astar seçimi | Yapı ve işlev | avantaj | dezavantaj |
| Oligo(dT) primeri (veya bağlantılı oligo(dT) primeri) | mRNA'nın poli(A) kuyruğundaki timin kalıntılarına uzatılmış tavlama;çapa oligo(dT) primeri, 3' ucunda (ankor bölgesi) bir G, C veya A içerir | Poli(A) kuyruklu mRNA'dan tam uzunlukta cDNA sentezi
Daha az başlangıç malzemesi mevcut olduğunda uygulanabilir
Sabitleme bölgesi, oligo(dT) primerinin mRNA'nın 5' poli(A) kuyruğuna bağlanmasını sağlar | Yalnızca poli(A) kuyruklu amplifiye genler için uygundur
Poli(A)'daki hazırlama bölgesinden*2 kesik cDNA elde edin
3' ucuna bağlanma eğilimi*
*Ankrajlı oligo(dT) primerler kullanılırsa bu olasılık en aza indirilir |
| rastgele astar
| RNA transkripsiyonu sırasında birden fazla bölgeye bağlanabilen 6 ila 9 baz uzunluğunda | Tüm RNA'lara (tRNA, rRNA ve mRNA) bağlanma
Önemli ikincil yapıya sahip transkriptler için veya daha az başlangıç materyali mevcut olduğunda uygundur
Yüksek cDNA Verimi | cDNA, tüm RNA'lardan ters kopyalanır, bu genellikle istenmez ve hedef mRNA'nın sinyalini seyreltebilir.
kesilmiş cDNA'yı al |
| diziye özgü primerler | Belirli mRNA dizilerini hedefleyen özel primerler | belirli cDNA kitaplığı
Hassasiyeti artırın
Ters qPCR primerlerini kullanma | Sadece tek bir hedef genin sentezi ile sınırlı |
Ters transkriptaz
Ters transkriptaz, DNA'yı sentezlemek için RNA kullanan bir enzimdir.Bazı ters transkriptazlar, RNaz aktivitesine sahiptir ve transkripsiyondan sonra RNA-DNA hibrit ipliklerindeki RNA ipliklerini bozabilir.RNase enzimatik aktivitesi yoksa, daha yüksek qPCR verimliliği için RNaseH eklenebilir.Yaygın olarak kullanılan enzimler arasında Moloney murin lösemi virüsü ters transkriptaz ve avian miyeloblastoma virüsü ters transkriptaz bulunur.RT-qPCR için, daha yüksek termostabiliteye sahip bir ters transkriptaz seçmek idealdir, böylece cDNA sentezi daha yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir, böylece reaksiyon boyunca tam aktivitelerini korurken daha yüksek ikincil yapıya sahip RNA'ların başarılı transkripsiyonu sağlanır ve daha yüksek cDNA verimleri elde edilir.
İlgili ürünler:
Foreasy M-MLV Ters Transkriptaz
Ters transkriptazın RNaz H aktivitesi
RNaseH, çift sarmallı DNA'nın verimli sentezine izin vererek, RNA-DNA duplekslerinden RNA şeritlerini bozabilir.Bununla birlikte, bir şablon olarak uzun mRNA kullanıldığında, RNA erken bozulabilir ve bu da kesik cDNA ile sonuçlanabilir.Bu nedenle, uzun transkriptlerin sentezi isteniyorsa, cDNA klonlaması sırasında RNaseH aktivitesini en aza indirmek genellikle yararlıdır.Tersine, RNase H aktivitesine sahip ters transkriptazlar, PCR'nin ilk döngüsü sırasında RNA-DNA duplekslerinin erimesini arttırdıkları için genellikle qPCR uygulamaları için faydalıdır.
Astar tasarımı
RT-qPCR'deki qPCR adımı için kullanılan PCR primerleri, ideal olarak, bir amplifikasyon primerinin potansiyel olarak gerçek bir ekson-intron sınırını kapsayabileceği bir ekson-ekzon bağlantısını kapsayacak şekilde tasarlanmalıdır.İntron içeren genomik DNA dizileri amplifiye edilmediğinden, bu tasarım kontamine genomik DNA'dan amplifiye edilen yanlış pozitif riskini azaltır.
Primerler eksonları veya ekson-ekzon sınırlarını ayıracak şekilde tasarlanamıyorsa, genomik DNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için RNA numunelerini RNaz içermeyen DNaz I veya dsDNaz ile işlemek gerekli olabilir.
RT-qPCR kontrolü
DNA kontaminasyonunu (genomik DNA veya önceki reaksiyonlardan elde edilen PCR ürünleri gibi) tespit etmek için tüm RT-qPCR deneylerine bir ters transkripsiyon negatif kontrolü (-RT kontrolü) dahil edilmelidir.Bu kontrol, ters transkriptaz hariç tüm reaksiyon bileşenlerini içerir.Bu kontrol ile ters transkripsiyon oluşmadığından, PCR amplifikasyonu gözlenirse, büyük ihtimalle DNA'dan kontaminasyon söz konusudur.
Gönderim zamanı: Ağu-02-2022
