Primer tasarım temeli (sorunların %99'u çözülebilir)
1. Primer uzunluğu: Ders kitabı 15-30 bp, genellikle yaklaşık 20 bp gerektirir.Spesifikliği sağlamak için gerçek durumun 18-24bp olması daha iyidir, ancak ne kadar uzun olursa o kadar iyidir, çok uzun primer de spesifiteyi azaltacak ve verimi azaltacaktır.
2. Primer amplifikasyon aralığı: 200-500bp uygundur ve fragman, belirli koşullar altında 10kb'ye genişletilebilir.
3. Primer tabanı: G+C içeriği %40-60 olmalıdır, çok az G+C amplifikasyon etkisi iyi değildir, çok fazla G+C spesifik olmayan bantların görünmesi kolaydır.ATGC en iyi rastgele dağıtılır ve 5'ten fazla pürin veya pirimidin nükleotidinden oluşan kümelerden kaçınılır.Stabiliteyi artırmak için 5' uç ve ara diziler için çoklu gc, 3' uçta zengin GC'den, son 3 baz için GC olmamasından veya son 5 bazın 3'ünde GC olmamasından kaçının.
4. Primerlerde ikincil yapıdan kaçının ve iki primer arasında, özellikle 3' uçta komplementasyondan kaçının, aksi takdirde primer dimer oluşacak ve spesifik olmayan amplifiye edilmiş bantlar oluşacaktır.
5. Primerlerin 3' ucundaki bazlar, özellikle son ve sondan bir önceki bazlar, eşleştirilmemiş terminal bazları nedeniyle PCR başarısızlığını önlemek için kesinlikle eşleştirilmelidir.
6. Primerler, uygun bölünme bölgelerine sahiptir veya bunlarla eklenebilir ve amplifiye edilmiş hedef sekans, tercihen, bölünme analizi veya moleküler klonlama için çok faydalı olan uygun bölünme bölgelerine sahip olmalıdır.
7. Primerlerin özgüllüğü: primerler, nükleik asit sekans veri tabanındaki diğer sekanslarla bariz bir homolojiye sahip olmamalıdır.
8. Yazılımı kullanmayı öğrenin: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Bu çevrimiçi tasarım en iyi sonucu verir).
Yukarıdaki içerik, astar tasarım problemlerinin en az %99'unu çözebilir.
Astar tasarımının ayrıntılarını kontrol edin
1. Astar uzunluğu
Genel primer uzunluğu 18~30 bazdır.Genel olarak astarın tavlama sıcaklığını belirleyen en önemli faktör astarın uzunluğudur.Astarın tavlama sıcaklığı genellikle seçilir (Tm değeri -5 ℃) ve bazıları doğrudan Tm değerini kullanır.Primerlerin tavlama sıcaklığını kabaca hesaplamak için aşağıdaki formüller kullanılabilir.
Primer uzunluğu 20bp'den az olduğunda: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Astar uzunluğu 20 bp'den büyük olduğunda: 62,3°C+0,41°C(%GC)-500/uzunluk-5°C
Ek olarak, tavlama sıcaklığını hesaplamak için birçok yazılım da kullanılabilir, hesaplama prensibi farklı olacaktır, bu nedenle bazen hesaplanan değerde küçük bir boşluk olabilir.PCR reaksiyonlarını optimize etmek için, en iyi etkinlik ve özgüllük için 54°C'den az olmayan tavlama sıcaklıklarını sağlayan en kısa primerler kullanılır.
Genel olarak, primer özgüllüğü her ek nükleotit için dört kat artar, böylece çoğu uygulama için minimum primer uzunluğu 18 nükleotiddir.Primer uzunluğunun üst sınırı çok önemli değildir, esas olarak reaksiyon verimliliği ile ilgilidir.Entropi nedeniyle, primer ne kadar uzun olursa, DNA polimerazın bağlanması için kararlı bir çift sarmallı şablon oluşturmak üzere hedef DNA'ya bağlanma hızı o kadar düşük olur.
Primerleri tasarlamak için yazılım kullanırken, primerlerin uzunluğu sırasıyla TM değeri ile belirlenebilir, özellikle floresan kantitatif PCR primerleri için, TM=60℃ veya benzeri kontrol edilmelidir.
2.GC içeriği
Genel olarak, primer dizilerindeki G+C içeriği %40~%60'tır ve bir çift primerin GC içeriği ve Tm değeri koordine edilmelidir.Primerin ciddi bir GC veya AT eğilimi varsa, primerin 5' ucuna uygun miktarda A, T veya G ve C kuyruğu eklenebilir.
3. Tavlama sıcaklığı
Tavlama sıcaklığı zincirsiz sıcaklıktan 5°C daha düşük olmalıdır.Primer bazların sayısı azsa, tavlama sıcaklığı uygun şekilde artırılabilir, bu da PCR'nin özgüllüğünü artırabilir.Baz sayısı fazla ise tavlama sıcaklığı uygun şekilde düşürülebilir.4°C ~ 6°C'lik bir çift primer arasındaki tavlama sıcaklığı farkı PCR verimini etkilemez, ancak ideal olarak bir çift primerin tavlama sıcaklığı aynıdır ve 55°C ~ 75°C arasında değişebilir.
4. Amplifikasyon şablonunun ikincil yapı alanından kaçının
Amplifiye fragmanı seçerken şablonun ikincil yapı bölgesinden kaçınmak en iyisidir.Hedef parçanın kararlı ikincil yapısı, şablon seçimine yardımcı olan ilgili bilgisayar yazılımı tarafından tahmin edilebilir ve tahmin edilebilir.Deneysel sonuçlar, genişletilecek bölgenin serbest enerjisi (△G) 58.6lkJ/mol'den az olduğunda genişletmenin genellikle başarısız olduğunu göstermektedir.
5. Hedef DNA ile uyumsuzluk
Amplifiye edilmiş hedef DNA sekansı büyük olduğunda, bir primer, hedef DNA'nın birçok kısmına bağlanabilir ve sonuçta birden fazla bandın görünmesine neden olabilir.Bu sefer BLAST yazılım testini kullanmak gerekiyor, web sitesi:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.İki diziyi hizala (bl2seq) öğesini seçin.
Primer dizilerini bölge 1'e ve hedef DNA dizilerini bölge 2'ye yapıştırmak birbirinin yerine kullanılabilir ve BLAST tamamlayıcı, antisens ve diğer olasılıkları hesaplar, böylece kullanıcıların her iki zincirin de duyu zinciri olup olmadığını fark etmesi gerekmez.Veritabanındaki dizinin GI numarasını biliyorsanız GI numarasını da girebilirsiniz, böylece dizinin büyük bir bölümünü yapıştırmanıza gerek kalmaz.Son olarak, primerin hedef DNA'da birden fazla homolog bölgeye sahip olup olmadığını görmek için Hizala 3'e tıklayın.
6. Astar terminali
Primerin 3' ucu, uzatmanın başladığı yerdir, dolayısıyla uyumsuzlukların buradan başlamasını önlemek önemlidir.3' ucu ardışık 3 G veya C'den fazla olmamalıdır çünkü bu, primerin G+C zenginleştirme dizisi bölgesinde yanlışlıkla tetiklenmesine neden olacaktır.3' ucu, özel PCR (AS-PCR) reaksiyonları dışında herhangi bir ikincil yapı oluşturamaz, primerin 3' ucu yanlış eşlenemez.Örneğin, kodlama bölgesi amplifiye edilirse, primerin 3' ucu kodonun üçüncü konumunda sonlandırılmamalıdır çünkü kodonun üçüncü konumu dejenere olmaya eğilimlidir, bu da amplifikasyonun özgüllüğünü ve etkinliğini etkileyecektir.Ekleme primerleri kullanırken, kodon kullanım tablosuna bakın, biyolojik tercihe dikkat edin, 3' uçta ekleme primerleri kullanmayın ve daha yüksek bir primer konsantrasyonu (1uM-3uM) kullanın.
7. Primerlerin ikincil yapısı
Primerlerin kendileri tamamlayıcı sekanslara sahip olmamalıdır, aksi takdirde primerlerin kendileri saç tokası yapılarına katlanır ve bu ikincil yapı, sterik engelleme nedeniyle primerlerin ve şablonların bağlanmasını etkiler.Yapay muhakeme kullanılırsa, primerlerin sürekli tamamlayıcı bazları 3bp'den büyük olmamalıdır.İki primer arasında tamamlayıcılık olmamalı, özellikle 3' ucunun tamamlayıcı üst üste gelmesinden kaçınılarak primer dimerlerinin oluşması önlenmelidir.Genel olarak, bir primer çifti arasında 4'ten fazla ardışık baz homolojisi veya tamamlayıcılığı olmamalıdır.
8. İşaretçiler veya lokuslar ekleyin
5' ucunun amplifikasyon özgüllüğü üzerinde çok az etkisi vardır ve bu nedenle amplifikasyon özgüllüğünü etkilemeden değiştirilebilir.Primer 5' ucunun modifikasyonu aşağıdakileri içermiştir: enzim kısıtlama bölgesinin eklenmesi;Etiketli biyotin, floresans, digoksin, Eu3+, vb. Protein bağlayıcı DNA dizilerini tanıtın;Mutasyon bölgelerinin tanıtılması, mutasyon dizilerinin eklenmesi ve eksik olması ve promotör dizilerinin tanıtılması vb. Ekstra bazlar, amplifikasyonun etkinliğini az ya da çok etkileyecek ve primer dimer oluşumu şansını artıracaktır, ancak bir sonraki adım için bazı tavizler verilmelidir.Kısıtlama bölgeleri ve destekleyici diziler gibi hedef dizide bulunmayan ek diziler, özgünlüğü etkilemeden primerin 5' ucuna eklenebilir.Bu diziler, primer Tm değerlerinin hesaplanmasına dahil edilmez, ancak tamamlayıcılık ve dahili ikincil yapı açısından test edilmelidir.
9. Alt klonlar
Çoğu zaman, PCR sadece ön klonlamadır ve ardından hedef fragmanı çeşitli vektörlere alt klonlamamız gerekir, bu nedenle PCR adımındaki bir sonraki işlem için ek bazlar tasarlamamız gerekir.
Alt klonlama için tasarlanan bazı diziler aşağıda özetlenmiştir.
Kısıtlama endonükleaz kısıtlama bölgesi eklendi
Enzim kısıtlama bölgelerinin eklenmesi, PCR ürünlerinin alt klonlanması için en sık kullanılan yöntemdir.Genel olarak, bölünme bölgesi altı bazdır, bölünme bölgesinin 5' ucuna ek olarak 2 ~ 3 koruyucu baz eklenmesi gerekir.Bununla birlikte, farklı enzimlerin ihtiyaç duyduğu koruyucu bazların sayısı farklıdır.Örneğin, SalⅠ koruyucu taban gerektirmez, EcoRⅤ 1 koruyucu taban gerektirir, NotⅠ 2 koruyucu taban gerektirir ve Hind Ⅲ 3 koruyucu taban gerektirir.
LIC kuyruğu ekler
LIC'nin tam adı, Navogen tarafından özellikle pET vektörünün parçası için icat edilen bir klonlama yöntemi olan Ligasyondan Bağımsız klonlamadır.LIC yöntemiyle hazırlanan pET taşıyıcısı, tamamlayıcı olmayan 12-15 bazlı tek sarmallı yapışkan uçlara sahiptir ve bunlar, hedef ekleme parçası üzerindeki karşılık gelen yapışkan uçları tamamlar.Amplifikasyon amaçları için eklenen parçanın primer 5' dizisi LIC vektörünü tamamlamalıdır.T4 DNA polimerazın 3'→5' ekstranekt aktivitesi, kısa bir süre sonra eklenen fragman üzerinde tek iplikli yapışkan bir uç oluşturabilir.Ürün ancak hazırlanan insert fragmanı ile vektörün karşılıklı tavlanmasından oluşabileceği için bu yöntem çok hızlı ve etkilidir ve yönlendirilmiş klonlamadır.
Yönlendirilmiş TA klonu kuyruk ekle
TA klonlaması, parçayı bir vektöre hedefleyemedi, bu nedenle daha sonra Invitrogen, bir ucunda dört belirgin baz GTGGS içeren klonlamayı hedefleyebilecek bir vektör tanıttı.Bu nedenle, PCR primerlerinin tasarımında, fragmanların "yönlendirilebilmesi" için tamamlayıcı diziler buna göre eklenmelidir.
Vaktiniz kısıtlıysa, geni vektörle birleştirerek doğrudan sentezi deneyebilirsiniz ki biz buna museküleristlerde ET gen sentezi diyoruz.
D. Füzyon içi klonlama yöntemi
Ligaz gerekmez, uzun reaksiyon gerekmez.Primerlerin tasarımında lineerleştirilmiş vektörün her iki ucundaki bir sekans dahil edildiği sürece, PCR ürünü ve lineerleştirilmiş vektör, BSA içeren infüzyon enzim solüsyonuna eklenir ve yarım saat oda sıcaklığında bekletilir, dönüşüm gerçekleştirilebilir.Bu yöntem özellikle büyük hacimli dönüşümler için uygundur.
10. Birleştirme astarı
Bazen, primer tasarımı hakkında sadece sınırlı sekans bilgisi bilinmektedir.Örneğin, sadece amino asit dizisi biliniyorsa, birleştirme primeri tasarlanabilir.Bir birleşme primeri, tek bir amino asidi kodlayan tüm farklı baz olasılıklarını temsil eden farklı dizilerin bir karışımıdır.Spesifikliği artırmak için, farklı organizmaların baz kullanım tercihlerine göre ilhakı azaltmak için kodon kullanım tablosuna başvurabilirsiniz.Hipoksantin, astarın tavlama sıcaklığını azaltmak için tüm bazlarla eşleştirilebilir.Ekli bazları primerin 3' ucunda kullanmayın çünkü son 3 bazın 3' ucunda tavlanması PCR'ı yanlış yerde başlatmak için yeterlidir.Daha yüksek primer konsantrasyonları (1μM ila 3μM) kullanılır çünkü birçok ekleme karışımındaki primerler hedef şablona özgü değildir.
PCR hammaddelerikontrol
1. Astar miktarı
Her primerin konsantrasyonu 0.1 ~ 1 umol veya 10 ~ 100 pmol'dür.En az miktarda astar ile istenen sonucu elde etmek daha iyidir.Yüksek konsantrasyonda primer, uyumsuzluğa ve spesifik olmayan amplifikasyona neden olacak ve primerler arasında dimer oluşturma şansını artıracaktır.
2. Astar konsantrasyonu
Primerlerin konsantrasyonu özgüllüğü etkiler.Optimum primer konsantrasyonu genellikle 0,1 ve 0,5μM arasındadır.Daha yüksek primer konsantrasyonları spesifik olmayan ürünlerin amplifikasyonuna yol açar.
3. Astarın tavlama sıcaklığı
Primerler için bir diğer önemli parametre de erime sıcaklığıdır (Tm).Bu, primerlerin ve tamamlayıcı dizilerin %50'sinin çift sarmallı DNA molekülleri olarak temsil edildiği sıcaklıktır.PCR tavlama sıcaklığını ayarlamak için Tm gereklidir.İdeal olarak, tavlama sıcaklığı, primerlerin hedef sekans ile etkili şekilde tavlanmasını sağlayacak kadar düşük, ancak spesifik olmayan bağlanmayı azaltacak kadar yüksektir.55 ℃ ila 70 ℃ arasında makul tavlama sıcaklığı.Tavlama sıcaklığı genellikle astar Tm'sinden 5 ℃ daha düşük olarak ayarlanır.
Tm'yi ayarlamak için, kullanılan formüle ve primerlerin sırasına bağlı olarak büyük ölçüde değişen birkaç formül vardır.Çoğu formül tahmini bir Tm değeri sağladığından, tüm tavlama sıcaklıkları yalnızca bir başlangıç noktasıdır.Özgüllük, tavlama sıcaklığını kademeli olarak yükselten çeşitli reaksiyonları analiz ederek geliştirilebilir.Tahmini Tm-5℃'nin altında başlayın ve tavlama sıcaklığını 2℃'lik artışlarla kademeli olarak artırın.Daha yüksek tavlama sıcaklığı, primer dimerlerin ve spesifik olmayan ürünlerin oluşumunu azaltacaktır.En iyi sonuçlar için, iki primer yaklaşık Tm değerlerine sahip olmalıdır.Primer çiftlerinin Tm farkı 5°C'den fazla ise, primerler döngüde daha düşük bir tavlama sıcaklığı kullanarak önemli bir yanlış başlangıç gösterecektir.İki primer Tm farklıysa, tavlama sıcaklığını en düşük Tm'den 5°C daha düşük olarak ayarlayın.Alternatif olarak, özgüllüğü artırmak için önce daha yüksek Tm için tasarlanmış tavlama sıcaklıklarında beş döngü gerçekleştirilebilir, ardından kalan döngüler daha düşük Tm için tasarlanmış tavlama sıcaklıklarında gerçekleştirilebilir.Bu, hedef şablonun kısmi bir kopyasının sıkı koşullar altında elde edilmesini sağlar.
4. Astar saflığı ve kararlılığı
Özel primerlerin standart saflığı çoğu PCR uygulaması için yeterlidir.Benzoil ve izobütilil gruplarının tuzdan arındırma ile uzaklaştırılması minimum düzeydedir ve bu nedenle PCR'ye müdahale etmez.Bazı uygulamalar, sentez işleminde tam uzunlukta olmayan dizileri çıkarmak için saflaştırma gerektirir.Bu kesik diziler, DNA sentezi kimyasının etkinliğinin %100 olmaması nedeniyle oluşur.Bu, DNA'yı 3' ila 5' yapmak için her baz eklendiğinde tekrarlanan kimyasal reaksiyonları kullanan dairesel bir işlemdir.Her iki döngüde de başarısız olabilirsiniz.Daha uzun primerler, özellikle 50 bazdan daha büyük olanlar, büyük oranda kesik sekanslara sahiptir ve saflaştırma gerektirebilir.
Primerlerin verimi, sentetik kimyanın etkinliği ve saflaştırma yönteminden etkilenir.Cytology ve Shengong gibi biyofarmasötik şirketlerin tümü, toplam oligonükleosid çıktısını sağlamak için minimum bir OD birimi kullanır.Özel astarlar kuru toz halinde sevk edilir.Nihai konsantrasyonun 100μM olması için primerleri TE'de yeniden çözmek en iyisidir.TE, deiyonize sudan daha iyidir çünkü suyun pH'ı genellikle asidiktir ve oligonükleositlerin hidrolizine neden olur.
Primerlerin stabilitesi saklama koşullarına bağlıdır.Kuru toz ve çözünmüş astarlar -20°C'de saklanmalıdır.TE içinde 10μM'den daha yüksek konsantrasyonlarda çözünen primerler -20°C'de 6 ay boyunca stabil bir şekilde saklanabilir, ancak oda sıcaklığında (15°C ila 30°C) yalnızca 1 haftadan daha kısa süre saklanabilir.Kuru toz astarlar -20 C de en az 1 yıl, oda sıcaklığında (15 C ile 30 C) 2 aya kadar saklanabilir.
5. Enzimler ve konsantrasyonları
Şu anda kullanılan Taq DNA polimeraz, temel olarak koliform bakteriler tarafından sentezlenen gen mühendisliği enzimidir.Tipik bir PCR reaksiyonunu katalize etmek için gereken enzim miktarı yaklaşık 2.5U'dur (100 ul'lik toplam reaksiyon hacmini ifade eder).Konsantrasyon çok yüksekse, spesifik olmayan amplifikasyona yol açabilir;konsantrasyon çok düşükse, sentetik ürün miktarı azaltılacaktır.
6. dNTP'nin kalitesi ve konsantrasyonu
dNTP'nin kalitesi, PCR amplifikasyonunun konsantrasyonu ve etkinliği ile yakından ilişkilidir.dNTP tozu taneciklidir ve uygun şekilde depolanmadığı takdirde değişkenliği biyolojik aktivitesini kaybeder.dNTP solüsyonu asidiktir ve PH'ını 7,0 ~ 7,5'e ayarlamak için 1M NaOH veya 1M Tris.HCL tampon solüsyonu ile yüksek konsantrasyonda kullanılmalıdır, az miktarda alt paketleme, -20°C'de donmuş saklama.Çoklu dondurma-çözme dNTP'yi düşürür.PCR reaksiyonunda dNTP 50 ~ 200umol/L olmalıdır.Özellikle dört DNTPS konsantrasyonunun eşit olmasına (eşit mol hazırlığı) dikkat edilmelidir.Herhangi birinin konsantrasyonu diğerlerinden farklıysa (daha yüksek veya daha düşük), uyumsuzluğa neden olur.Çok düşük konsantrasyon, PCR ürünlerinin verimini azaltacaktır.dNTP, Mg2+ ile birleşebilir ve serbest Mg2+ konsantrasyonunu azaltabilir.
7. Şablon (hedef gen) nükleik asit
Şablon nükleik asidin miktarı ve saflaştırma derecesi, PCR'nin başarısı veya başarısızlığı için anahtar bağlantılardan biridir.Geleneksel DNA saflaştırma yöntemleri, örnekleri sindirmek ve atmak için genellikle SDS ve proteaz K kullanır.SDS'nin ana işlevleri şunlardır: hücre zarı üzerindeki lipitleri ve proteinleri çözmek, böylece zar proteinlerini çözerek hücre zarını yok etmek ve hücrede nükleer proteinleri ayrıştırmak, SDS ayrıca proteinlerle birleşebilir ve çökelebilir;Proteaz K, proteinleri, özellikle DNA'ya bağlı histonları hidrolize edebilir ve sindirebilir ve daha sonra proteinleri ve diğer hücre bileşenlerini çıkarmak için organik çözücü fenol ve kloroform kullanabilir ve nükleik asidi çökeltmek için etanol veya izopropil alkol kullanabilir.Ekstre edilen nükleik asit, PCR reaksiyonları için bir şablon olarak kullanılabilir.Genel klinik tespit numuneleri için, hücreleri eritmek, patojenleri lizatlamak, sindirmek ve kromozomlardaki proteinleri serbest hedef genlere çıkarmak için hızlı ve basit bir yöntem kullanılabilir ve doğrudan PCR amplifikasyonu için kullanılabilir.RNA şablon ekstraksiyonu, RNaz'ın RNA'yı parçalamasını önlemek için genellikle guanidin izotiyosiyanat veya proteaz K yöntemini kullanır.
8.Mg2+ konsantrasyonu
Mg2+, PCR amplifikasyonunun özgüllüğü ve verimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.Genel PCR reaksiyonunda, çeşitli dNTP'lerin konsantrasyonu 200umol/L olduğunda, uygun Mg2+ konsantrasyonu 1.5 ~ 2.0mmol/L'dir.Mg2+ konsantrasyonu çok yüksektir, reaksiyon özgüllüğü azalır, spesifik olmayan amplifikasyon meydana gelir, çok düşük konsantrasyon Taq DNA polimerazın aktivitesini düşürerek reaksiyon ürünlerinin azalmasına neden olur.
Magnezyum iyonları, verimi etkileyen DNA polimeraz aktivitesi gibi PCR'nin çeşitli yönlerini etkiler;Başka bir örnek, özgüllüğü etkileyen primer tavlamasıdır.dNTP ve şablon magnezyum iyonuna bağlanarak enzim aktivitesi için gereken serbest magnezyum iyonu miktarını azaltır.Optimum magnezyum iyonu konsantrasyonu, farklı primer çiftleri ve şablonlar için değişiklik gösterir, ancak 200μM dNTP ile tipik bir PCR başlangıç konsantrasyonu 1,5 mM'dir (not: Gerçek zamanlı kantitatif PCR için, floresan problu 3 ila 5 mM magnezyum iyonu solüsyonu kullanın).Serbest magnezyum iyonlarının daha yüksek konsantrasyonları verimi arttırır, ancak aynı zamanda spesifik olmayan amplifikasyonu arttırır ve doğruluğu azaltır.Optimum konsantrasyonu belirlemek için, 1 mM'den 3 mM'ye kadar 0.5 mM'lik artışlarla magnezyum iyonu titrasyonları yapıldı.Magnezyum iyon optimizasyonuna bağımlılığı azaltmak için Platinum Taq DNA polimeraz kullanılabilir.Platinum Taq DNA polimeraz, Taq DNA polimeraza göre daha geniş bir magnezyum iyon konsantrasyonu aralığında işlevini sürdürebilir ve bu nedenle daha az optimizasyon gerektirir.
9. Pcr'yi teşvik eden katkı maddeleri
Tavlama sıcaklığının, primer tasarımının ve magnezyum iyonu konsantrasyonunun optimizasyonu, çoğu şablonun oldukça spesifik amplifikasyonu için yeterlidir;ancak, yüksek GC içeriğine sahip olanlar da dahil olmak üzere bazı şablonlar ek önlemler gerektirir.DNA'nın erime sıcaklığını etkileyen katkı maddeleri, ürün özgüllüğünü ve verimini iyileştirmenin başka bir yolunu sağlar.En iyi sonuçlar için şablonun tam denatürasyonu gereklidir.
Ayrıca ikincil yapı, primer bağlanmasını ve enzim uzamasını engeller.
Formamid, DMSO, gliserin, betain ve PCRx Enhancer Solution gibi PCR katkı maddeleri amplifikasyonu artırır.Muhtemel mekanizmaları, erime sıcaklığını düşürmek, böylece primerlerin tavlanmasına yardımcı olmak ve ikincil yapı bölgesi boyunca DNA polimeraz uzantısına yardımcı olmaktır.PCRx Çözümünün başka avantajları da vardır.Platinum Taq DNA polimeraz ve Platinum Pfx DNA polimeraz ile kullanıldığında minimum magnezyum iyonu optimizasyonu gerekir.Böylece Platinum tekniği, üçüncü yaklaşım olan magnezyum iyonu optimizasyonuna bağımlılığı azaltırken özgüllüğü artırmak için katkı maddesi ile birleştirilir.En iyi sonuçlar için, katkı maddelerinin konsantrasyonu, özellikle Taq DNA polimerazı inhibe eden DMSO, formamid ve gliserol optimize edilmelidir.
10. Sıcak başlangıç
Hot start PCR, iyi bir primer tasarımına ek olarak PCR özgüllüğünü geliştirmek için en önemli yöntemlerden biridir.Taq DNA polimerazın optimum uzama sıcaklığı 72°C olmasına rağmen, polimeraz oda sıcaklığında aktif kalır.Böylece PCR reaksiyonunun hazırlanması sırasında ve termal döngünün başlangıcında tutma sıcaklığı tavlama sıcaklığından düşük olduğunda spesifik olmayan ürünler üretilir.Bir kez oluştuktan sonra, bu spesifik olmayan ürünler etkili bir şekilde çoğaltılır.Hot-start PCR, primer tasarımı için kullanılan sahalar, sahaya yönelik mutasyonlar, ekspresyon klonlama veya DNA mühendisliği için kullanılan genetik elemanların yapımı ve manipülasyonu gibi genetik elemanların konumu ile sınırlı olduğunda özellikle etkilidir.
Taq DNA polimerazın aktivitesini sınırlamak için yaygın bir yöntem, buz üzerinde PCR reaksiyon solüsyonu hazırlamak ve bunu önceden ısıtılmış bir PCR aparatına yerleştirmektir.Bu yöntem basit ve ucuzdur, ancak enzimin aktivitesini tamamlamaz ve bu nedenle spesifik olmayan ürünlerin amplifikasyonunu tamamen ortadan kaldırmaz.
Termal hazırlama, PCR aparatı denatürasyon sıcaklığına ulaşana kadar temel bir bileşeni inhibe ederek DNA sentezini geciktirir.Taq DNA polimerazın gecikmeli eklenmesi dahil olmak üzere çoğu manuel termal başlatma yöntemi, özellikle yüksek verimli uygulamalar için külfetlidir.Diğer termal astarlama yöntemleri, magnezyum iyonları veya enzimler dahil olmak üzere temel bir bileşeni çevrelemek veya şablonlar ve tamponlar gibi reaktif bileşenleri fiziksel olarak izole etmek için bir mum kalkanı kullanır.Termal döngü sırasında, balmumu eridikçe çeşitli bileşenler salınır ve birlikte karıştırılır.Manuel sıcak başlatma yöntemi gibi, mum koruma yöntemi de kullanışsızdır ve kirlenmeye eğilimlidir ve yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir.
Platin DNA polimeraz, otomatik sıcak başlangıçlı PCR için uygun ve verimlidir.Platin Taq DNA polimeraz, Taq DNA polimeraza karşı monoklonal antikor ile birleştirilmiş rekombinant Taq DNA polimerazdan oluşur.Antikorlar, uzun süreli sıcaklık tutma sırasında enzim aktivitesini inhibe etmek için PCR ile formüle edilir.Taq DNA polimeraz, denatürasyon adımının 94°C izolasyonu sırasında reaksiyona salındı ve tam polimeraz aktivitesini eski haline getirdi.Termal başlatma için kimyasal olarak modifiye edilmiş Taq DNA polimerazın aksine, Platinum enzimi, polimerazı aktive etmek için 94°C'de (10 ila 15 dakika) uzun süreli yalıtım gerektirmez.PlatinumTaq DNA polimeraz ile Taq DNA polimeraz aktivitesinin %90'ı, 94°C'de 2 dakika sonra geri yüklendi.
11. Nest-PCR
Yuvalanmış primerler kullanılarak art arda yapılan amplifikasyon turları özgüllüğü ve duyarlılığı artırabilir.İlk tur, 15 ila 20 döngülük standart bir amplifikasyondur.Başlangıç amplifikasyon ürününün küçük bir fraksiyonu 100 ila 1000 kez seyreltildi ve 15 ila 20 döngü için ikinci amplifikasyon turuna eklendi.Alternatif olarak, başlangıçtaki amplifiye ürün, jel saflaştırması ile boyutlandırılabilir.İkinci amplifikasyon turunda, birinci primer içindeki hedef diziye bağlanabilen yuvalanmış bir primer kullanılır.Yuvalanmış PCR'nin kullanımı, her iki primer setini tamamlayan az sayıda hedef sekans olduğundan, çoklu hedef bölgelerin amplifikasyon olasılığını azaltır.Aynı primerlerle aynı toplam döngü sayısı (30 ila 40), spesifik olmayan bölgeleri çoğalttı.Yuvalanmış PCR, sınırlı hedef dizilerin (örneğin, nadir mrnalar) duyarlılığını artırır ve zor PCRS'nin (örneğin, 5' RACE) özgüllüğünü geliştirir.
12. Azalan PCR
Azalan PCR, PCR'nin ilk birkaç döngüsü için sıkı tavlama koşulları kullanarak özgüllüğü artırır.Döngü, tahmini Tm'den yaklaşık 5°C daha yüksek bir tavlama sıcaklığında başlar, ardından her bir döngü, tavlama sıcaklığı Tm 5°C'nin altına düşene kadar 1°C'den 2°C'ye düşürülür.Yalnızca en yüksek homolojiye sahip hedef şablon güçlendirilecektir.Bu ürünler, amplifiye spesifik olmayan ürünleri dışlayarak sonraki döngülerde genişlemeye devam ediyor.Azalan PCR, AFLP DNA parmak izi gibi primer ve hedef şablon arasındaki homoloji derecesinin bilinmediği yöntemler için kullanışlıdır.
İlgili PCR Kitleri
2× PCR KahramanıTMMix sistemi, sıradan PCR Mix sistemine göre PCR inhibitörlerine karşı daha yüksek toleransa sahiptir ve çeşitli karmaşık şablonların PCR amplifikasyonu ile kolayca başa çıkabilir.Eşsiz reaksiyon sistemi ve yüksek verimliliğe sahip Taq Hero, PCR reaksiyonunun daha yüksek amplifikasyon verimliliğine, özgüllüğüne ve duyarlılığına sahip olmasını sağlar.
Daha yüksek amplifikasyon verimliliği
5'→3' DNA polimeraz aktivitesine ve 5'→3' ekzonükleaz aktivitesine sahiptir, 3'→5' ekzonükleaz aktivitesi yoktur.
Gerçek Zamanlı PCR Easyᵀᴹ-SYBR Yeşil I Kiti
Spesifik—optimize edilmiş tampon ve sıcak başlatmalı Taq enzimi, spesifik olmayan amplifikasyonu ve primer dimer oluşumunu önleyebilir
Yüksek hassasiyet—şablonun düşük kopyalarını algılayabilir
Kit, benzersiz bir Foregene ters transkripsiyon reaktifi ve Foregene HotStar Taq DNA Polimerazını, reaksiyonun amplifikasyon verimliliğini ve özgüllüğünü etkili bir şekilde iyileştirmek için benzersiz bir reaksiyon sistemiyle birleştirir.
Gönderim zamanı: Mayıs-09-2023
