Amplifikasyon sinyali yok

1.Kitteki Taq DNA Polimeraz, kitin yanlış saklanması veya son kullanma tarihinin geçmesi nedeniyle aktivitesini kaybeder.
Öneri: Kitin saklama koşullarını onaylayın;PCR sistemine yeniden uygun miktarda Taq DNA Polimeraz ekleyin veya ilgili deneyler için yeni bir Real Time PCR Kiti satın alın.

2. DNA şablonunda çok sayıda Taq DNA Polimeraz inhibitörü vardır.
Öneri: Şablonu yeniden saflaştırın veya kullanılan şablon miktarını azaltın.

3.Mg2+ konsantrasyonu uygun değil.
Öneri: Sağladığımız 2× Real PCR Mix'in Mg2+ konsantrasyonu 3,5 mM'dir.Ancak bazı özel primerler ve şablonlar için Mg2+ konsantrasyonu daha yüksek olabilir.Bu nedenle, Mg2+ konsantrasyonunu optimize etmek için doğrudan MgCl2 ekleyebilirsiniz.Optimizasyon için her seferinde Mg2+ 0,5 mM'nin artırılması önerilir.

4. PCR amplifikasyon koşulları uygun değil ve primer dizisi veya konsantrasyonu uygun değil.
Öneri: primer dizisinin doğruluğunu ve primerin bozulmadığını onaylayın;amplifikasyon sinyali iyi değilse tavlama sıcaklığını düşürmeye çalışın ve primer konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.

5. Kalıp miktarı çok az veya çok fazla.
Öneri: Şablon doğrusallaştırma gradyan seyreltmesi gerçekleştirin ve Real Time PCR deneyi için en iyi PCR etkisine sahip şablon konsantrasyonunu seçin.

NTC'nin çok yüksek floresan değeri var

1. Çalışma sırasında oluşan reaktif kontaminasyonu.
Öneri: Real Time PCR deneyleri için yeni reaktiflerle değiştirin.

2.PCR reaksiyon sisteminin hazırlanması sırasında kontaminasyon meydana geldi.
Öneri: Çalıştırma sırasında gerekli koruyucu önlemleri alın, örneğin: lateks eldiven giymek, filtreli bir pipet ucu kullanmak, vb.

3. Primerler bozulur ve primerlerin bozunması spesifik olmayan amplifikasyona neden olur.
Öneri: Primerlerin bozulup bozulmadığını saptamak için SDS-PAGE elektroforezi kullanın ve Real Time PCR deneyleri için bunları yeni primerlerle değiştirin.

Primer dimer veya spesifik olmayan amplifikasyon

1.Mg2+ konsantrasyonu uygun değil.
Öneri: Sağladığımız 2× Real PCR EasyTM Mix'in Mg2+ konsantrasyonu 3,5 mM'dir.Ancak bazı özel primerler ve şablonlar için Mg2+ konsantrasyonu daha yüksek olabilir.Bu nedenle, Mg2+ konsantrasyonunu optimize etmek için doğrudan MgCl2 ekleyebilirsiniz.Optimizasyon için her seferinde Mg2+ 0,5 mM'nin artırılması önerilir.

2. PCR tavlama sıcaklığı çok düşük.
Öneri: PCR tavlama sıcaklığını her seferinde 1°C veya 2°C artırın.

3. PCR ürünü çok uzun.
Öneri: Real Time PCR ürününün uzunluğu 100-150bp arasında olmalı, 500bp'den fazla olmamalıdır.

4. Primerler bozulur ve primerlerin bozunması spesifik amplifikasyonun ortaya çıkmasına neden olur.
Öneri: Primerlerin bozulup bozulmadığını saptamak için SDS-PAGE elektroforezi kullanın ve Real Time PCR deneyleri için bunları yeni primerlerle değiştirin.

5.PCR sistemi uygun değil veya sistem çok küçük.
Öneri: PCR reaksiyon sisteminin çok küçük olması tespit doğruluğunun azalmasına neden olacaktır.Real Time PCR deneyini yeniden çalıştırmak için kantitatif PCR cihazı tarafından önerilen reaksiyon sistemini kullanmak en iyisidir.

Kantitatif değerlerin zayıf tekrarlanabilirliği

1. Cihaz arızalı.
Öneri: Aletin her bir PCR deliği arasında hatalar olabilir, bu da sıcaklık yönetimi veya algılama sırasında zayıf tekrar üretilebilirliğe yol açar.Lütfen ilgili cihazın talimatlarına göre kontrol edin.

2. Numune saflığı iyi değil.
Öneri: Saf olmayan numuneler, şablonun ve primerlerin saflığını içeren deneyin zayıf tekrarlanabilirliğine yol açacaktır.Şablonu yeniden saflaştırmak en iyisidir ve primerler en iyi şekilde SDS-PAGE ile saflaştırılır.

3.PCR sistemi hazırlama ve saklama süresi çok uzun.
Öneri: Real Time PCR sistemini PCR deneyi için hazırladıktan hemen sonra kullanın ve çok uzun süre kenarda bırakmayın.

4. PCR amplifikasyon koşulları uygun değil ve primer dizisi veya konsantrasyonu uygun değil.
Öneri: primer dizisinin doğruluğunu ve primerin bozulmadığını onaylayın;amplifikasyon sinyali iyi değilse tavlama sıcaklığını düşürmeye çalışın ve primer konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.

5.PCR sistemi uygun değil veya sistem çok küçük.
Öneri: PCR reaksiyon sisteminin çok küçük olması tespit doğruluğunun azalmasına neden olacaktır.Real Time PCR deneyini yeniden çalıştırmak için kantitatif PCR cihazı tarafından önerilen reaksiyon sistemini kullanmak en iyisidir.