Biz deneyimli üretici olduk.Büyük indirimli Çin Yüksek Hassasiyetli Tek Adımlı Prob Rt- için pazarının önemli sertifikalarında çoğunluğu kazanmakQpcrKit V2, Kalite fabrikanın hayatıdır, Müşterinin talebine odaklanmak, şirketin hayatta kalması ve gelişmesinin kaynağıdır, Gelişinizi dört gözle bekliyoruz, dürüstlük ve iyi niyetle çalışma tutumuna bağlıyız!
Biz deneyimli üretici olduk.pazarının önemli sertifikalarında çoğunluğu kazanmakÇin Taq DNA Polimeraz, Qpcr, Firmamızın vaatleri: uygun fiyatlar, kısa üretim süresi ve tatmin edici satış sonrası hizmet, ayrıca istediğiniz zaman fabrikamızı ziyaret etmenizi bekliyoruz.Şimdi birlikte hoş ve uzun vadeli bir işimiz olmasını diliyorum!!!

Açıklamalar

Bu kit, RT-qPCR reaksiyonları için kültürlenmiş hücre örneklerinden hızlı bir şekilde RNA salabilen benzersiz bir lizis tampon sistemi kullanır, böylece zaman alıcı ve zahmetli RNA saflaştırma sürecini ortadan kaldırır.RNA şablonu sadece 7 dakikada elde edilebilir.Kit tarafından sağlanan 5×Direct RT Mix ve 2×Direct qPCR Mix-SYBR reaktifleri, gerçek zamanlı kantitatif PCR sonuçlarını hızlı ve etkili bir şekilde elde edebilir.

5×Direct RT Mix ve 2×Direct qPCR Mix-SYBR, güçlü inhibitör toleransına sahiptir ve numunelerin lizatı doğrudan RT-qPCR için şablon olarak kullanılabilir.Bu kit, benzersiz RNA yüksek afiniteli Foregene ters transkriptaz ve Hot D-Taq DNA polimeraz, dNTP'ler, MgCl içerir₂, reaksiyon tamponu, PCR optimize edici ve dengeleyici.

Özellikler

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kit bileşenleri

Özellikler ve avantajlar

■ Basit ve etkili: Cell Direct RT teknolojisi ile RNA örnekleri sadece 7 dakikada alınabilir.

■ Numune talebi küçüktür, 10 hücre kadar düşük test edilebilir.

■ Yüksek verim: 384, 96, 24, 12, 6 kuyulu plakalarda kültürlenen hücrelerde RNA'yı hızla saptayabilir.

■ DNA Eraser, salınan genomları hızlı bir şekilde kaldırabilir ve sonraki deneysel sonuçlar üzerindeki etkiyi büyük ölçüde azaltabilir.

■ Optimize edilmiş RT ve qPCR sistemi, iki adımlı RT-PCR ters transkripsiyonunu daha verimli ve PCR'yi daha spesifik ve RT-qPCR reaksiyon inhibitörlerine karşı daha dirençli hale getirir.

Kit uygulaması

Uygulama kapsamı: kültürlenmiş hücreler.

- Örnek parçalanmasıyla salınan RNA: yalnızca bu kitin RT-qPCR şablonu için geçerlidir.

- Kit aşağıdaki amaçlar için kullanılabilir: gen ekspresyonu analizi, siRNA aracılı gen susturma etkisinin doğrulanması, ilaç taraması vb.

Diyagram

Depolama ve Raf ömrü

Bu kitin I. Kısmı 4°C'de saklanmalıdır;Kısım II -20°C'de saklanmalıdır.

Foregene Protease Plus II 4°C'de saklanmalıdır, -20°C'de dondurmayın.

Reaktif 2×Direct qPCR Mix-SYBR karanlıkta -20°C'de saklanmalıdır;sık kullanılırsa, kısa süreli saklama için 4°C'de de saklanabilir (10 gün içinde tüketin). Biz deneyimli bir üreticiyiz.Büyük indirim Çin Yüksek Hassasiyetli Tek Adımlı Prob Rt-Qpcr Kiti V2 için pazarının önemli sertifikalarında çoğunluğu kazanmak, Kalite fabrika hayatıdır, Müşterinin talebine odaklanmak, şirketin hayatta kalması ve gelişmesinin kaynağıdır, Dürüstlük ve iyi niyetle çalışma tutumuna bağlıyız, gelmenizi dört gözle bekliyoruz!
Büyük indirimÇin Taq DNA Polimeraz, Qpcr, Firmamızın vaatleri: makul fiyatlar, kısa üretim süresi ve tatmin edici satış sonrası hizmet, ayrıca istediğiniz zaman fabrikamızı ziyaret etmenizi bekliyoruz.Şimdi birlikte hoş ve uzun vadeli bir işimiz olmasını diliyorum!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -takman

Ref.No.DRT-01021/01022

≤ 1000.000 hücre kullanan hücre doğrudan RT-qPCR için

Ürün tanıtımı

Bu ürün, RT-qPCR reaksiyonları için kültürlenmiş hücre örneklerinden hızlı bir şekilde RNA salmak için benzersiz bir lizis tampon sistemi kullanır, bu da zaman alan ve zahmetli RNA saflaştırma sürecini ortadan kaldırır ve gerekli RNA şablonunu elde etmek için sadece 7 dakikada, kit tarafından sağlanan 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ile gerçek zamanlı kantitatif PCR sonuçlarını hızlı ve verimli bir şekilde elde edebilir.

5× Direct RT Mix ve 2× Direct qPCR Mix-Taqman, güçlü inhibitör toleransına sahiptir ve şablon olarak ölçülecek numunenin lizatını kullanarak etkili ters çevirme ve spesifik amplifikasyon gerçekleştirebilir.Reaktif, Foregene Ters Transkriptaz, Sıcak D-Taq DNA Polimeraz, dNTP'ler, MgCl içerir₂, Örnekleri hızlı ve kolay bir şekilde tespit etmek için lizis tamponu ile kullanılabilen ve yüksek hassasiyet, özgüllük ve stabilite özelliklerine sahip Reaksiyon Tamponu, PCR Optimize Edici ve Stabilizatör.

Ürün Özellikleri

RNA örneklerini almak için 7 dakika gibi kısa bir süre alan basit, etkili Cell Direct RT teknolojisi.

Numune gereksinimleri küçüktür ve deney için en az 10 kültürlenmiş hücre kullanılabilir.

384, 96, 24, 12 ve 6 oyuklu plakalar gibi kültürlenmiş hücrelerin hızlı RNA alımı için yüksek verim.

DNA Eraser, salınan genomları hızlı bir şekilde kaldırabilir ve sonraki deneysel sonuçlar üzerindeki etkiyi büyük ölçüde azaltır.

Optimize edilmiş RT ve qPCR sistemleri, daha verimli ters transkripsiyon, özgüllük ve daha güçlü RT-qPCR reaksiyon inhibitörü toleransı ile iki adımlı RT-PCR'yi etkinleştirir.

Kit uygulaması

Uygulama kapsamı: Kültürlenmiş hücreler.

Numune lizisi yorumlanmış RNA: yalnızca iki adımlı bir RT-qPCR şablonu olarak kullanılır.

Kitler aşağıdaki amaçlar için kullanılabilir: gen düzenleyici ifade analizi, alel testi, ilaç taraması vb.

Kit sınırlamaları

Güçlendirilmiş fragmanlar ≤ 300 bp.

Kitler, hücrelerin taze kültürlenmesi için kullanılır.

Ürün kalite kontrolü

FOREGENE'nin Toplam Kalite Yönetim Sistemine göre, Cell Direct RT-qPCR serisi kitlerin her partisi, kitlerin her partisinin kalitesinin güvenilirliğini ve istikrarını sağlamak için birçok kez titiz bir şekilde test edilir.

Kit içeriği

*:Hücre Parçalama, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ayrıca satın alınabilir, detaylar Ek 1'de (SAYFA 13) verilmiştir.

Depolama koşulları

1. Nakliye Koşulları

Kitin <4 °C durumunda olduğundan emin olmak için tüm düşük sıcaklıkta buz paketi kutusu taşıma işlemi.

2. Saklama koşulları

Kısım I'i 4°C'de ve Kısım II'yi -20°C'de saklayın.

Foregene Protease Plus II -20°C'de dondurulmadan 4°C'de saklanmalıdır.

Reaktif 2× Direkt qPCR Mix-Taqman -20°C'de veya sık kullanılıyorsa (10 gün içinde) kısa süreli kullanım için 4°C'de saklanır.

Kit bileşen bilgileri

Tampon CL: Hücre lizis reaksiyonları için gerekli ortamı sağlar.

Tampon ST: Sonraki RT üzerindeki etkileri önlemek için lizattaki aktif maddeyi sonlandırır.

DNA Silgisi: DNA sökücü, genomun çıkarılmasının sonraki deneylere etkisi.

5× Doğrudan RT Karışımı: Optimum hizalama için yüksek RNA afiniteli Foregene Ters Transkriptaz, RNaz İnhibitörü, dNTP'ler, stabilizatörler, geliştiriciler, optimize ediciler ve ters transkripsiyon primerleri içerir (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Astar).

Foregene Protease Plus II: Parçalama tamponu bağlamında, hücreler nükleik asitleri serbest bırakmak için parçalanır.

2× Doğrudan qPCR Mix-Taqman: Bu reaktif, Sıcak D-Taq DNA Polimeraz, dNTP'ler, MgCl içerir₂, reaksiyon tamponu, PCR optimize edici ve dengeleyici.

20× ROX Referans Boyası: Genellikle ABI, Stratagene ve diğer firmaların Real Time PCR amplifikasyon cihazlarında kullanılır, PCR dozlama hatalarından kaynaklanan PCR tüpleri ile tüpler arasındaki farkı ayarlamak için kullanılır.Farklı aletler için gerekli olan 20× ROX Referans Boya konsantrasyonu farklıdır ve kullanıcı bunu cihazın tavsiye edilen konsantrasyonuna göre ekleyebilir.

RNaz İçermeyen ddH₂O: İki aşamalı RT-qPCR reaksiyonları için RNaz içermeyen sterilize edilmiş ultra saf su.

Önlemler:(Kiti kullanmadan önce önlemleri dikkatlice okuduğunuzdan emin olun)

Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için deneyin çalışma yöntemine dikkat edin.

RNase kontaminasyonunu ve RNA bozulmasını önlemek için deney ortamının ve mutfak eşyalarının temizliğine dikkat edin.

Taze veya iyi korunmuş hücre örnekleri alın ve asla tekrarlanan dondurularak çözülmüş hücre örnekleri kullanmayın.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman, tekrarlanan donma-çözülmeden kaçınmalıdır, aksi halde ters transkripsiyonu ve PCR etkinliğini etkiler.

hazırlıkerzakönceoperasyon

Bu kiti kullanmadan önce talimatları dikkatlice okuduğunuzdan emin olun.Cell Direct RT-qPCR Kit basit, kullanışlı ve çalıştırması hızlıdır ve talimatlar kitin tamamı ve doğru şekilde nasıl kullanılacağı hakkında eksiksiz bilgi sağlar.Lütfen kullanmadan önce gerekli deney malzemelerini ve ekipmanlarını hazırlayın.

Deneysel malzeme ve ekipman

◆ Kültür hücreleri.

◆ 1,5 ml veya 2 ml, RNaz-/DNaz İçermeyen santrifüj tüpü, RNaz-/DNaz İçermeyen uç, 0,2 ml steril qPCR tüpü.

◆ qPCR makinesi, pipet, masaüstü santrifüjü (≥13.400×g) (deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak), vb.

Emniyet

◆ Bu ürün yalnızca bilimsel araştırma amaçlıdır, lütfen farmasötik, klinik, gıda ve kozmetik amaçlı kullanmayın.

◆ Kimyasalları kullanırken uygun laboratuvar kıyafetleri, eldivenler, koruyucu gözlükler vb. giyin.

Operasyonrehberler

Hücre Parçalama sistemleri, RT sistemleri ve qPCR reaksiyon solüsyonu ek paketleri, ayrıntılar için Ek 1'de (SAYFA 13) ayrıca satın alınabilir.

Operasyon Rehberi

A: Numune RNA salımı

1. Hücreler ön işleme tabi tutuldu: Hücre kültürü plakasını soğuk PBS ile yıkayın, ardından hücreleri lize edin (10-10⁶), 10⁶ RNA ekstraksiyonu ve saflaştırması için Foregene the Cell ve Total RNA İzolasyon Kiti (DE-03111) veya Animal Total RNA İzolasyon Kiti (DE-03011) önerilir.

1.1.Yapışkan hücreler (örnek olarak 24 oyuklu plaka)

1.1.1.Her kuyudaki hücre sayısını belirleyin, hücre sayısının 1 × 10 olduğunu belirleyin⁵ve kültür ortamını kültür kabından çıkarmak için bir pipet kullanın.

1.1.2.Her kuyuya 200 ul önceden soğutulmuş 1 × PBS ekleyin.Art arda pipetleme yapmayın ve kuyucuklardan PBS'yi çıkarın.Plakayı eğin ve mümkün olduğu kadar çok PBS çıkarın.2. adıma geçin.

1.1.3.Farklı hücre kültürü kabı veya bir hücre kültürü kabındaki bir referans numarası tablosu 1-1, hücre yıkama için önceden soğutulmuş 1 x PBS ilave edildi.

Tablo 1-1: Farklı sayıda hücre için PBS dozu

Not：Sağlam bir yapışık hücre sağlamak için，yıkama sırasında çok sayıda hücre kaybı önlenir.

1.2.Gözenekli olmayan plakalarda kültürlenmiş süspansiyon hücreleri veya yapışık hücreler

1.2.1.Çok kuyucuklu olmayan plakalarda kültürlenen yapışık hücreler (süspansiyon hücreleri sonraki adım 1.2.2'den başlar), hücreleri normal hücre toplama yöntemine göre toplar ve ayırır ve bunları bir kültür plakasına veya santrifüj tüpüne yerleştirir;tripsinizasyon kullanılıyorsa, hücreleri toplamak ve kalıntı tripsin çıkarmak için santrifüjleme gerektirir, hücreleri dağıtmak için tek tek hücrelere PBS yeniden süspanse edilmiş hücreler eklenir.

1.2.2.Sayılan hücre sayısından sonra, bölünen hücreler 1×10⁵ tüpleri santrifüjleyin, 1000 x g'de 10 dakika santrifüjleyerek hücreleri toplayın.

1.2.3.Santrifüj tüpüne 200 µl PBS ekleyin, art arda pipetleme yapmayın ve doğrudan PBS'yi aspire edin.2. adıma ilerleyin. (Çökeltilmesi zorsa ve hücreler tekrar süspanse edildiyse, süpernatan atıldıktan 10 dakika sonra 1000xg santrifüjlenebilir, hücre peleti 2. adıma geçer)

2.Hücre parçalanması: Sıcaklığı oda sıcaklığına ayarlanmış Tampon CL'yi, DNA Eraser'ı ve Foregene Protease Plus II'yi aşağıdaki tablo 1-2'ye göre çıkarın.

Tablo 1-2: bölünme sistem hazırlığı (Not: buz üzerinde hazırlıkta)

3.(Örnek olarak 24 kuyucuklu plaka) Her kuyucuğa 200 μl hücre lizis ana karışımı pipetleyin, 5-10 kez tekrar tekrar üfleyin, 5 dakika oda sıcaklığında (20-25 ℃) inkübe edin.

Not：Baloncuk oluşumunu önlemek için lütfen pipetleme sırasında pipet ölçeği 200μl veya altına ayarlandı.Hücreler parçalandıktan sonra bulanık görünebilir ki bu normaldir.

4.(Örnek olarak 24 kuyucuklu plak) sıvıya 20 µl Buffer ST ilave edildi (Tablo 1-3'te gösterilen miktarda farklı lizis sistemlerinde Buffer ST ilave edildi), tekrarlanan pipetlemelerle 5-10 kez, oda sıcaklığında(20-25 ℃) 2 dakika inkübe edildi.

Not：Yüzeyin altına yerleştirilen pipet ucu, lizatın eklenmesini sağlar，kabarcık oluşumunu önlemek için, lütfen pipetleme ölçeği 200μl veya altına ayarlandığında.

Tablo 1-3：Tampon ST Ekle

5.Lizat sonraki RT-qPCR deneyleri için kullanılır.Sonraki deneyler zamanında gerçekleştirilemezse, lütfen en fazla 2 saat buz üzerinde tutun ve -20°C veya -80°C'de saklayın (en fazla üç ay).

B: RT sistem hazırlığı

1. 5 × Direct RT Mix'i çıkarın ve bir buz banyosuna yerleştirin, doğal olarak erimesine izin verin ve daha sonra kullanmak üzere hafifçe karıştırın;RNaz İçermeyen ddH2O'yu çıkarın ve eritin ve daha sonra kullanmak üzere bir buz banyosuna yerleştirin.Aşağıdaki Tablo 2-1'e göre reaksiyon sistemini buz üzerinde hazırlayın.

Tablo 2-1: RT reaksiyon sisteminin hazırlanması

2.Sistemin formülasyonu tamamlandıktan sonra, aşağıdaki tablo 2-2'de hafifçe karıştırılmış ve kısaca santrifüjlenmiş reaksiyon koşulları RT reaksiyonu.

Tablo 2-2: RT Reaksiyon durumu ayarı

3. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, reaksiyon ürünü qPCR için doğrudan buz üzerine yerleştirildi, lütfen uzun süreli korumayı -20 ℃ veya -80 ℃ olarak ayarlayın.

Not: Saflaştırılmamış şablonun kullanılması nedeniyle, ters transkripsiyon ürününde beyaz çökeltiler görünebilir.Bu normal bir fenomendir.Sonraki deneyler için süpernatantı hemen santrifüjleyin.

Ortaya çıkan RT reaksiyon solüsyonu bir sonraki Step Real Time PCR reaksiyon sistemlerine eklenir, reaksiyon sisteminin %10-30'u arasında değişen miktarlarda eklenmesi önerilir.

C: qPCR reaksiyon sistemi hazırlığı

1. Bir reaksiyon sistemi hazırlamak için aşağıdaki tablo 3-1'e göre adım cDNA şablonunda hazırlanan uygun miktarda B.

Not: cDNA şablon miktarı, qPCR sisteminin %10-30'unu oluşturur.Örneğin, 20μl qPCR sisteminde 2-6 μl lizis tamponu ekleyin, ancak 6 μl'den fazla eklemeyin.

2. qPCR reaksiyonu için iyi qPCR koşullarının optimizasyonu (Tavlama sıcaklığı, vb.) (Tablo 3-2'de verilen reaksiyon koşulları).

Not: Daha iyi sonuçlar elde etmek için qPCR reaksiyonları için optimize edilmiş koşulları kullanmayı deneyin.

Tablo 3-1: PCR reaksiyon sisteminin hazırlanması

1*: Primer reaksiyon performansının düşük olduğu durumlarda primer konsantrasyonu 50-900 nM aralığında ayarlanabilir.

Not: qPCR sistemi, deneysel ihtiyaçlara ve floresan döngüleyici modeline göre ayarlanabilir.50'de qPCR içinμl sistemi, reaktif dozajını 20'ye göre orantılı olarak ayarlayın.μsistem.

2*: Floresans kantitatif termal döngüleyiciye göre uygun nihai ROX Referans Boyası konsantrasyonunu seçin.Yaygın floresan kantitatif döngüleyiciler için en uygun ROX Referans Boya konsantrasyonları aşağıdaki tabloda gösterilmektedir:

Tablo 3-2: qPCR reaksiyon koşulları sağlanır

Not: En iyi qPCR etkisini elde etmek için, farklı şablonlar ve farklı primerler için reaksiyon koşullarını optimize etmek üzere gradyan PCR kullanılabilir.PCR reaksiyon koşulları flüoresan analiz cihazına, şablona, ​​primere vb. bağlı olarak değişir. Spesifik işlemde, optimum reaksiyon koşullarının flüoresan kantitatif termal döngüleyicinin özel koşullarına, şablon tipine, ilgilenilen parçanın boyutuna, amplifiye edilmiş parçanın baz dizisine ve GC içeriğine ve tavlama sıcaklığı, reaksiyon süresi vb. dahil olmak üzere primerlerin uzunluğuna göre tasarlanması gerekir.

Real Time PCR primer tasarım ilkeleri

İleri Astar ve Ters Astar

Real Time PCR için primer tasarımı çok önemlidir.Primerler, PCR amplifikasyonunun özgüllüğü ve etkinliği ile ilgilidir ve aşağıdaki ilkelere göre tasarlanabilir:

◆ Primer uzunluğu: 18-30bp.

◆ GC içeriği: %40-60.

◆ Tm değeri: Primer 5 gibi primer tasarım yazılımı, primerin Tm değerini verebilir.Yukarı ve aşağı primerlerin Tm değerleri mümkün olduğu kadar yakın olmalıdır.Tm hesaplama formülü de kullanılabilir: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR yapılırken, genellikle 5 °C'lik primer Tm değerinin altındaki bir sıcaklık, tavlama sıcaklığı olarak seçilir (tavlama sıcaklığındaki karşılık gelen artış, PCR reaksiyonunun özgüllüğünü artırabilir).

◆ Primerler ve PCR ürünleri:

◆ Tasarım primeri PCR amplifikasyon ürünü uzunluğu tercihen 100-150bp'dir.

◆ Şablonun ikincil yapısal alanındaki tasarım astarlarından mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.

◆ Primerlerin yukarı ve aşağı yöndeki 3' uçları arasında 2 veya daha fazla tamamlayıcı baz oluşumundan kaçının.

◆ Primer 3' terminal tabanı art arda 3 ek G veya C ile mevcut olamaz.

◆ Primerlerin kendileri tamamlayıcı yapılara sahip olamazlar, aksi takdirde PCR amplifikasyonunu etkileyen saç tokası bir yapı oluşur.

◆ ATCG, primer sekansında mümkün olduğu kadar eşit dağıtılmalı ve T olarak 3' terminal tabanından kaçınılmalıdır.

Ek1：Cell DoğrudanRT-qPCR Kit bileşenlerit ek paket

1. Hücre Parçalama Çözümü