Merkezi dogmada RNA'nın, DNA ve protein ekspresyonu arasındaki transkripsiyonel aracı olduğu iyi bilinmektedir.DNA tespiti ile karşılaştırıldığında, RNA tespiti organizmalardaki gen ekspresyonunu daha objektif bir şekilde yansıtabilir.RNA içeren deneyler şunları içerir: qRT-PCR, RNA-Seq ve füzyon gen tespiti, vb.Çöp içeri, çöp dışarı, eğer RNA'nın kalitesi iyi değilse, o zaman deneysel sonuçlar yetersiz olmalı ve özellikle yanlış veri veya zayıf tekrarlanabilirlik olarak kendini göstermelidir.Bu nedenle, RNA'nın işlenmesine daha fazla dikkat edilmelidir ve sonraki deneysel verilerin kesinliğini ve doğruluğunu sağlamak için kalite kontrol bağlantısı da daha önemlidir.

RNA'nın kalite kontrolü için genellikle aşağıdaki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır:

• spektrofotometri
• agaroz jel elektroforezi
• Agilent Biyoanalizör
• gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR
• Qubit floresan boya yöntemi

01 Spektrofotometri

RNA konjuge çift bağlara sahiptir ve 260nm dalga boyunda bir absorpsiyon zirvesine sahiptir.Lambert-Beer yasasına göre, 260nm'deki absorpsiyon zirvesinden RNA konsantrasyonunu hesaplayabiliriz.Ayrıca 260nm, 280nm ve 230nm absorpsiyon piklerinin oranına göre RNA'nın saflığını da hesaplayabiliriz.280nm ve 230nm, sırasıyla proteinlerin ve küçük moleküllerin absorpsiyon zirveleridir.Nitelikli RNA saflığının A260/A280 ve A260/A230 oranı 2'den büyük olmalıdır. 2'den küçük ise RNA numunesinde protein veya küçük molekül kontaminasyonu olduğu ve tekrar saflaştırılması gerektiği anlamına gelir.Kontaminasyon kaynakları, PCR reaksiyonlarının amplifikasyon verimliliğinin inhibe edilmesi gibi aşağı akış deneylerini etkileyerek hatalı kantitatif sonuçlara yol açacaktır.RNA'nın saflığının sonraki sonuçlar üzerinde büyük etkisi vardır, bu nedenle spektrofotometri genellikle nükleik asit deneylerinde ilk adımda vazgeçilmez bir kalite kontrol halkasıdır.

Şekil 1. Tipik RNA/DNA Absorpsiyon Spektrumu

02 Agaroz jel elektroforezi

Saflığa ek olarak, RNA'nın bütünlüğü de RNA'nın kalitesini değerlendirmek için önemli göstergelerden biridir.RNA'nın bozunması, numunede çok sayıda kısa fragmana yol açacaktır, bu nedenle etkili bir şekilde tespit edilebilen ve referans sekans tarafından kapsanabilen RNA fragmanlarının sayısı azalacaktır.RNA bütünlüğü, %1 agaroz jel üzerinde toplam RNA'nın elektroforezi ile kontrol edilebilir.Bu yöntem, jeli kendiniz yapılandırabilir veya bütünlük testi için önceden hazırlanmış E-Gel™ Sistemini kullanabilir.Toplam RNA'nın %80'den fazlası, çoğunluğu 28S ve 18S rRNA'dan (memeli sistemlerinde) oluşan ribozomal RNA'dır.Kaliteli RNA, 5 Kb ve 2 Kb'de sırasıyla 28S ve 18S parlak çubuklar olan iki bariz parlak çubuk gösterecek ve oran 2:1'e yakın olma eğiliminde olacaktır.Dağınık bir durumdaysa, bu, RNA örneğinin bozulmuş olabileceği anlamına gelir ve RNA'nın kalitesini daha fazla test etmek için daha sonra açıklanan yöntemin kullanılması önerilir.

Şekil 2. Agaroz jel elektroforezinde bozulmuş (şerit 2) ve bozulmamış RNA'nın (şerit 3) karşılaştırması

03 Agilent Biyoanalizör

Yukarıda açıklanan ve RNA'nın bütünlüğünü basit ve hızlı bir şekilde tanımlamamıza yardımcı olabilecek agaroz jel elektroforez yöntemine ek olarak, RNA'nın bütünlüğünü belirlemek için Agilent biyoanalizörünü de kullanabiliriz.RNA konsantrasyonunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için mikroakışkanlar, kapiler elektroforez ve floresans kombinasyonunu kullanır.Agilent biyoanalizör, RNA örneğinin profilini analiz etmek için yerleşik algoritmayı kullanarak, bir referans RNA bütünlük değeri, RNA Bütünlük Numarası (bundan böyle RIN olarak anılacaktır) [1] hesaplayabilir.RIN değeri ne kadar büyük olursa, RNA'nın bütünlüğü o kadar yüksek olur (1 son derece bozulmuştur, 10 en eksiksizdir).RNA içeren bazı deneyler, RIN'in kalite değerlendirmesi için bir parametre olarak kullanılmasını önerir.Yüksek verimli dizileme deneylerini (bundan böyle NGS olarak anılacaktır) örnek alarak, Thermo Fisher'ın Oncomine panel serisindeki B hücresi ve T hücresi antijen reseptörlerini saptamak için kullanılan Oncomine™ İnsan Bağışıklık Repertuarı yönergeleri, RIN değerleri 4'ten büyük olan numunelerin, Daha etkili okumalar ve klonların ölçülebileceğini önerir (Şekil 3).Farklı paneller için önerilen farklı aralıklar vardır ve genellikle daha yüksek bir RIN, daha etkili veriler sağlayabilir.

Şekil 3, Oncomine™ İnsan Bağışıklık Repertuarı deneylerinde, RIN değeri 4'ten büyük olan numuneler, daha etkili okumaları ve T hücre klonlarını tespit edebilir.【2】

Ancak, RIN değerinin de bazı sınırlamaları vardır.RIN, NGS deneysel verilerinin kalitesi ile yüksek bir korelasyona sahip olmasına rağmen, FFPE numuneleri için uygun değildir.FFPE numuneleri uzun süre kimyasal olarak işlenmiştir ve ekstrakte edilen RNA genellikle nispeten düşük bir RIN değerine sahiptir.Ancak bu, deneyin etkili verilerinin yetersiz olması gerektiği anlamına gelmez.FFPE örneklerinin kalitesini doğru bir şekilde değerlendirmek için RIN dışında ölçümler kullanmamız gerekir.Agilent bioanalyzer, RIN'e ek olarak, RNA kalitesinin bir değerlendirme parametresi olarak DV200 değerini de hesaplayabilir.DV200, bir RNA örneğinde 200 bp'den büyük fragmanların oranını hesaplayan bir parametredir.DV200, FFPE örnek kalitesinin RIN'den daha iyi bir göstergesidir.FFPE ile ekstrakte edilen RNA için, etkili bir şekilde tespit edilebilen gen sayısı ve genlerin çeşitliliği ile çok yüksek bir korelasyona sahiptir [3].DV200, FFPE'nin kalite tespitindeki eksiklikleri giderebilse de, Agilent biyoanalizör, numunelerde inhibitör olup olmadığı da dahil olmak üzere, RNA numunelerindeki kalite sorunlarını kapsamlı bir şekilde analiz edemez.İnhibitörlerin kendileri, aşağı akış deneylerinin amplifikasyon verimliliğini etkileyebilir ve faydalı veri miktarını azaltabilir.Numunede bir inhibitör olup olmadığını bilmek için, aşağıda açıklanan gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR yöntemini benimseyebiliriz.

04 gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR

Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR yöntemi, yalnızca numunedeki inhibitörleri tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda FFPE numunesindeki RNA'nın kalitesini de doğru bir şekilde yansıtır.Agilent biyolojik analizörleri ile karşılaştırıldığında, gerçek zamanlı floresan kantitatif enstrümanlar, daha geniş uygulamaları nedeniyle büyük biyolojik laboratuvarlarda daha popülerdir.RNA örneklerinin kalitesini test etmek için, yalnızca GUSB (Kat no. Hs00939627) gibi dahili referans genler için primer problar satın almamız veya hazırlamamız gerekir.Mutlak kantitatif deneyler yapmak için bu primerler, problar ve standartlar (bilinen konsantrasyondaki toplam RNA) kullanılarak, etkili RNA fragmanı konsantrasyonu, RNA kalitesinin değerlendirme standardı (kısaca Fonksiyonel RNA Kantitasyonu (FRQ)) olarak hesaplanabilir.Bir NGS testinde, RNA örneklerinin FRQ'sunun etkin veri hacmi ile çok yüksek bir korelasyona sahip olduğunu bulduk.0,2ng/uL FRQ'dan büyük tüm numuneler için, okumaların en az %70'i etkili bir şekilde referans diziyi kapsayabilir (Şekil 4).

Şekil 4, floresan kantitatif yöntemle tespit edilen FRQ değeri, NGS deneyinde elde edilen etkili verilerle çok yüksek bir korelasyona (R2>0.9) sahiptir.Kırmızı çizgi, 0,2 ng/uL'ye (log10 = -0,7) eşit FRQ değeridir.【4】

Gerçek zamanlı kantitatif PCR yöntemi, FFPE numunelerine uygulanabilmesinin yanı sıra numunelerdeki inhibitörleri de etkili bir şekilde izleyebilir.Tespit edilecek numuneyi Dahili Pozitif Kontrol (IPC) ve Tahlili ile reaksiyon sistemine ekleyebilir ve ardından Ct değerini elde etmek için floresan kantifikasyonu gerçekleştirebiliriz.Numunesiz reaksiyonda Ct değerinin Ct değerinin gerisinde kalması, numunede inhibitörün bulunduğunu gösterir ve reaksiyondaki amplifikasyon etkinliğini engeller.

05 Qubit floresan boya yöntemi

Qubit Fluorometer, kullanımı kolay ve hemen hemen her moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan, nükleik asit konsantrasyonu ve saflık tespiti için en yaygın kullanılan küçük cihazdır.Tespit ve nükleik asit bağlayıcı floresan boya (Qubit tespit reaktifi) ile nükleik asit konsantrasyonunu doğru bir şekilde hesaplar.Qubit yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir ve RNA'yı pg/µL konsantrasyonuna kadar doğru bir şekilde ölçebilir.Thermo Fisher'ın en son yeni modeli Qubit 4.0, nükleik asit konsantrasyonunu doğru bir şekilde ölçme konusundaki iyi bilinen yeteneğine ek olarak, RNA'nın bütünlüğünü de saptayabilir.Qubit 4.0'ın RNA tespit sistemi (RNA IQ Assay), iki spesifik floresan boyayı aynı anda tespit ederek RNA'nın bütünlüğünü tespit eder.Bu iki floresan boya, sırasıyla büyük fragmanlara ve küçük RNA fragmanlarına bağlanabilir.Bu iki flüoresan boya, numunedeki büyük RNA parçalarının oranını gösterir ve bundan RNA kalitesini temsil eden IQ (Bütünlük ve Kalite) değeri hesaplanabilir.IQ değeri hem FFPE hem de FFPE olmayan numuneler için geçerlidir ve sonraki sıralama kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir.Örnek olarak NGS deneylerini ele alırsak, Ion torrent™ platformunda gerçekleştirilen RNA-Seq testi deneylerinde, IQ değerleri 4'ten büyük olan çoğu numunenin en az %50 etkili okumaları vardır (Şekil 5).Yukarıda belirtilen algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, Qubit IQ Assay yalnızca çalıştırmanın daha uygun olması ve daha az zaman alması (beş dakika içinde) olmakla kalmaz, aynı zamanda ölçülen parametre IQ değeri ile aşağı akış deneylerinin veri kalitesi arasında büyük bir korelasyona sahiptir.

Şekil 5, Qubit RNA IQ değeri ile RNA-Seq'in haritalanmış okumaları arasında büyük bir korelasyon var.【5】

Yukarıdaki giriş sayesinde, herkesin farklı RNA kalite kontrol yöntemleri hakkında yeterli bilgiye sahip olduğuna inanıyorum.Pratikte seçebilirsiniznumune tipine ve mevcut araçlara göre karşılık gelen yöntem.Yalnızca RNA'nın kalitesini iyi kontrol ederek, düşük numune kalitesinin neden olduğu sonraki deneylerin başarısızlığını önleyebilir, böylece değerli zaman, enerji ve maliyetten tasarruf edebiliriz.

Referans ürünler:

Hayvan Total RNA İzolasyon Kiti

Hücre Toplam RNA İzolasyon Kiti

Referanslar

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA ölçümlerine bütünlük değerleri atamak için bir RNA bütünlük numarası.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertuar Kullanım Kılavuzu (Yayın No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Gelişmiş Kalite Metrikleri Arşiv Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Doku Örneklerinden Türetilmiş RNA'yı Değerlendirmek İçin, Toksikolojik Bilimler, Cilt 170, Sayı 2, Ağustos 2019, Sayfa 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/