1. İlk anlayış

Bu aşamada, büyüklerimizin önünde hata yapmaktan kaçınmak için bazı kavramları ve terminolojiyi anlamamız gerekir, örneğin:

S: RT-PCR, qPCR, Gerçek Zamanlı PCR ve Gerçek Zamanlı RT-PCR arasındaki fark nedir?

Cevap: RT-PCR, ters transkripsiyon PCR'dir(ters transkripsiyon PCR, RT-PCR), polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) yaygın olarak kullanılan bir çeşididir.RT-PCR'de, bir RNA dizisi, daha sonra PCR ile DNA amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılan tamamlayıcı DNA'ya ters kopyalanır.
Gerçek zamanlı PCR ve qPCR(Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR) aynı şeydir, her ikisi de gerçek zamanlı kantitatif PCR'dir; bu, her PCR döngüsünün gerçek zamanlı veri kayıtlarına sahip olduğu anlamına gelir, bu nedenle başlangıç ​​şablonlarının sayısı hassas analizle ayarlanabilir.

Hem Gerçek Zamanlı PCR (gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR) hem de Ters transkripsiyon PCR (ters transkripsiyon PCR) RT-PCR olarak kısaltılmış gibi görünse de, uluslararası sözleşme şöyledir: RT-PCR özellikle ters transkripsiyonu ifade eder.PCR , Gerçek zamanlı PCR genellikle qPCR (kantitatif gerçek zamanlı PCR) olarak kısaltılır..

Ve gerçek zamanlı RT-PCR (RT-qPCR), floresan kantitatif teknoloji ile birleştirilmiş ters transkripsiyon PCR'dir.: önce RNA ters transkripsiyonundan cDNA (RT) elde edin ve ardından kantitatif analiz (qPCR) için Gerçek Zamanlı PCR kullanın.Çoğu laboratuvar RT-qPCR, yani RNA ekspresyonu aşağı regülasyonu üzerine araştırma yapar, bu nedenle laboratuvarda herkesin bahsettiği qPCR aslında RT-qPCR'yi ifade eder, ancak klinik uygulamalarda hala birçok DNA testi olduğunu unutmayın.Hepatit B virüsü HBV tespiti gibi kantitatif analiz.

Soru: Çok sayıda floresan kantitatif PCR okuduktan sonra, amplifiye fragman neden 80-300bp aralığında kontrol edilmelidir?

Cevap: Her gen dizisinin uzunluğu farklıdır, bazıları birkaç kb, bazıları yüzlerce bp'dir, ancak primerleri tasarlarken ürün uzunluğunun sadece 80-300 bp olmasını şart koşmamız gerekir, çok kısa veya çok uzun floresan kantitatif PCR tespiti için uygun değildir.Ürün fragmanı, primer-dimerden ayırt edilemeyecek kadar kısadır.Primer-dimerin uzunluğu yaklaşık 30-40bp'dir ve 80bp'den az ise primer-dimer mi yoksa ürün mü olduğunu ayırt etmek zordur.Ürün fragmanı çok uzunsa, 300 bp'yi aşarsa, bu kolaylıkla düşük amplifikasyon verimliliğine yol açar ve gen miktarını etkili bir şekilde tespit edemez.

Örneğin, bir sınıfta kaç kişi olduğunu saydığınızda, yalnızca kaç ağız olduğunu saymanız gerekir.Aynı şey, genleri tespit ettiğinizde de geçerlidir, bir genin yalnızca belirli bir sekansını tespit etmeniz gerekir, tüm sekansı yapacaktır.İnsanları saymak istiyorsanız, hem ağızları hem de burunları, kulakları ve gözlükleri saymanız gerekir ve hata yapmak kolaydır.

Genişletmek için, biyolojik araştırmalarda, noktadan bölgeye birçok araştırma vakası vardır, çünkü herhangi bir türün gen dizisi çok uzundur, tüm fragmanları ölçmek gereksizdir ve imkansızdır, örneğin belirli bir bakteri popülasyonunun sayısını anlamak için muhafazakar bakteri dizisini gerçekleştiren bakteriyel 16S dizilimi gibi.

S: qPCR astar tasarımı için en uygun uzunluk nedir?

Cevap: Genel olarak konuşursak, astar uzunluğu yaklaşık 20-24 bp'dir, bu daha iyidir.Tabii ki, astarı tasarlarken astarın TM değerine dikkat etmeliyiz çünkü bu, optimum tavlama sıcaklığı ile ilgilidir.Birçok deneyden sonra 60°C'nin daha iyi bir TM değeri olduğu kanıtlanmıştır.Tavlama sıcaklığı çok düşükse, kolayca spesifik olmayan amplifikasyona yol açacaktır.Tavlama sıcaklığı çok yüksekse, amplifikasyon verimliliği nispeten düşük olacak, amplifikasyon eğrisinin zirvesi daha geç başlayacak ve CT değeri gecikecektir.

S: Boya yönteminin prob yönteminden farkı nedir?

Cevap: Boya yöntemiSYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, vb. gibi bazı floresan boyalar kendi başlarına ışık yaymazlar, ancak çift sarmallı DNA'nın küçük oluğuna bağlandıktan sonra floresan yayarlar.Bu nedenle, PCR reaksiyonunun başlangıcında, makine floresan sinyalini algılayamaz.Reaksiyon, tavlama-uzatma aşamasına ulaştığında, çift sarmal açılır ve DNA polimerazın etkisi altında yeni bir sarmal sentezlenir ve flüoresan molekül, dsDNA küçük oluğuna bağlanır.PCR döngülerinin sayısı arttıkça, giderek daha fazla boya çift sarmallı DNA ile birleştirilir ve flüoresan sinyali de sürekli olarak güçlendirilir.Boya yöntemi esas olarak bilimsel araştırmalarda kullanılır.
Not: Deneyi yaparken dikkat edin, boyanın insan DNA'sı ile birleşmesi gerekiyor, dikkat edin floresan bir kişiye dönüştürün.

Boya yöntemi (solda) Prob yöntemi (sağda)
Not: Deneyi yaparken dikkat edin, boyanın insan DNA'sı ile birleşmesi gerekiyor, dikkat edin floresan bir kişiye dönüştürün.

SYBR Green Ⅰ, DNA'nın küçük oluğuna bağlanır

Prob yöntemiTaqman probu en yaygın kullanılan hidroliz probu.Probun 5' ucunda genellikle FAM olan bir floresan grup vardır ve probun kendisi hedef gene tamamlayıcı bir dizidir.3' ucunda bir floresan söndürme grubu vardır.Floresan rezonans enerji transferi (Förster rezonans enerji transferi, FRET) prensibine göre, raportör floresan grup (donör floresan molekül) ve söndürücü floresan grup (alıcı floresan molekül) uyarıldığında Spektrum örtüştüğünde ve mesafe çok yakın olduğunda (7-10nm), donör molekülün uyarılması alıcı molekülün floresansını indüklerken otofloresans zayıflar.Bu nedenle, PCR reaksiyonunun başlangıcında, prob sistemde serbest ve bozulmamış olduğunda, raportör floresan grubu floresan yaymayacaktır.Tavlama sırasında primer ve prob şablona bağlanır.Uzatma aşamasında, polimeraz sürekli olarak yeni zincirleri sentezler.DNA polimerazın 5'-3' eksonükleaz aktivitesi vardır.Proba ulaşırken, DNA polimeraz probu şablondan hidrolize edecek, raportör floresan grubunu söndürücü floresan grubundan ayıracak ve floresan sinyalini serbest bırakacaktır.Prob ile şablon arasında bire bir ilişki olduğu için, prob yöntemi, testin doğruluğu ve hassasiyeti açısından boya yöntemine göre üstündür.Teşhiste esas olarak prob yöntemi kullanılır.

S: Mutlak ölçüm nedir?Bağıl Nicelik Belirleme Nedir?

Cevap: Mutlak kantifikasyon, 1 ml kanda kaç tane HBV virüsü olduğu gibi, qPCR ile test edilecek numunenin ilk kopya sayısının hesaplanması anlamına gelir.Göreceli ölçümle elde edilen sonuç, başka bir referans numuneye göre belirli bir numunedeki hedef gen miktarındaki değişikliktir ve gen ekspresyonu yukarı veya aşağı regüle edilir.

S: RNA ekstraksiyonu miktarı, ters transkripsiyon verimliliği ve amplifikasyon verimliliği deney sonuçlarını etkiler mi?
S: Numune saklama, ekstraksiyon reaktifleri, ters transkripsiyon reaktifleri ve ışık ileten sarf malzemeleri deney sonuçlarını etkiler mi?
S: Deneysel verileri hangi yöntem düzeltebilir?

Bu konularla ilgili olarak, bunları aşağıdaki gelişmiş ve gelişmiş bölümlerde ayrıntılı olarak açıklayacağız.
2. Gelişmiş bilgi

Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR ile ilgili olarak, her yıl binlerce bilimsel araştırma makalesinin yayınlandığı gerçeğini kabul etmeliyiz ve aralarında floresan kantitatif PCR teknolojisi de azımsanmayacak bir sayıdır.

Floresan kantitatif PCR deneyini ölçmek için ortak bir standart yoksa, sonuçlar büyük ölçüde değişebilir.Aynı türün aynı geni için, aynı işleme yöntemiyle, tespit sonuçları da büyük ölçüde değişecek ve geç kalanların aynı sonuçları tekrar etmesi zor olacaktır.Hangisinin doğru hangisinin yanlış olduğunu kimse bilemez.

Bu, floresan kantitatif PCR'nin hileli bir teknoloji veya güvenilmez bir teknoloji olduğu anlamına mı gelir?Hayır, çünkü floresan kantitatif PCR daha hassas ve daha doğrudur ve biraz yanlış işlem tamamen zıt sonuçlar verecektir.Küçük bir kayıp bin mil uzakta.Makalenin yazarı, hakemler tarafından defalarca işkence görebilir.Aynı zamanda derginin hakemleri de farklı deneysel sonuçlar arasından seçim yapmakta zorlanıyor.

Sonuç olarak, gerçek zamanlı PCR deneylerinde fikir birliği eksikliğine işaret ediyor.Bu amaçla, sektördeki kıdemli bilim adamları standartları formüle etmeye başladılar,katkıda bulunanlardan bu standartları karşılamak için makalede gerekli bazı deneysel ve veri işleme ayrıntılarını (gerekli veriler dahil) sağlamalarını istemek.

Gözden geçirenler, bu ayrıntıları okuyarak deneyin kalitesini değerlendirebilir;gelecekteki okuyucular bunu deneyi tekrarlamak veya deneyi geliştirmek için de kullanabilir.O halde bu şekilde elde edilen deneysel sonuçlar bilgi dolu, kaliteli ve kullanışlıdır.

MIBBI (Biyolojik ve Biyomedikal Araştırmalar için Minimum Bilgi -http://www.mibbi.org) ortaya çıktı.MIBBI, deneyler için standartlar sağlayan bir projedir..Doğada yayınlanır.Bu proje, şimdi tartışacağımız hücre biyolojisi, Mikroarray, qPCR vb. dahil olmak üzere çeşitli biyolojik deneyleri hedeflemektedir ve yazıları gönderirken her tür deneyi sağlar.Bu bilgi her zaman sağlanmalıdır.

MIBBI projesinde floresan kantitatif PCR ile ilgili iki makale bulunmaktadır.:
·RDML (Gerçek Zamanlı PCR Veri İşaretleme Dili) – gerçek zamanlı kantitatif PCR verileri için yapılandırılmış bir dil ve raporlama kılavuzu;
·MIQE (Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Deneylerinin Yayınlanması İçin Minimum Bilgi) – gerçek zamanlı kantitatif PCR deneyleri hakkındaki makaleleri yayınlamak için minimum bilgi.
Öncelikle terminoloji belirtimi olan RDML'den bahsedelim.

Her şey için standart bir tanım yoksa tartışmaya devam etmek imkansızdır, bu yüzden sınavda terimlerin açıklanması çok önemlidir.
Floresan kantitatif PCR deneyinde kullanılan terminoloji aşağıdaki içeriği içerir.QIAGEN bizim için en iyi özeti yaptı.Aşağıdakilerin hepsi kurumal .

Amplifikasyon eğrisi
Amplifikasyon eğrisi, apsis olarak döngü sayısı ve ordinat olarak reaksiyon sırasında gerçek zamanlı floresans yoğunluğu ile PCR işlemi sırasında yapılan eğriyi ifade eder.

Mükemmel bir amplifikasyon eğrisi aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: taban çizgisi düz veya biraz azalmış ve bariz bir yükseliş eğilimi yok;eğrinin bükülme noktası açıktır ve üstel fazın eğimi amplifikasyon verimliliği ile orantılıdır.Eğim ne kadar büyük olursa amplifikasyon verimliliği o kadar yüksek olur;genel amplifikasyon eğrisi Paralellik iyidir, bu da her bir tüpün amplifikasyon verimliliğinin benzer olduğunu gösterir;düşük konsantrasyonlu numunelerin amplifikasyon eğrisinin üstel fazı açıktır.

Temel (Temel)
Taban çizgisi, erken döngünün gürültü seviyesidir, genellikle 3. ve 15. döngü arasında ölçülür, çünkü amplifikasyon ürününün neden olduğu floresans değeri artışı bu dönemde tespit edilemez.Taban çizgisini hesaplamak için kullanılan döngü sayısı değişebilir ve yüksek şablon miktarları kullanılıyorsa veya hedef genin ekspresyon seviyesi yüksekse azaltılması gerekebilir.

Taban çizgisinin ayarlanması, doğrusallık amplifikasyon eğrisinden floresan verilerinin görüntülenmesini gerektirir.Taban çizgisi, amplifikasyon eğrisinin büyümesi taban çizgisi döngü üst sayısından daha büyük bir döngü sayısı ile başlayacak şekilde ayarlanır.Referans çizgilerinin her hedef dizi için ayrı ayrı ayarlanması gerekir.Erken döngülerde tespit edilen ortalama floresans değerlerinin amplifiye edilmiş ürünlerde elde edilen floresans değerlerinden çıkarılması gerekir.Çeşitli Real-Time PCR yazılımının en son sürümleri, bireysel numuneler için temel ayarların otomatik optimizasyonuna izin verir.

PCR amplifikasyon reaksiyonunun ilk birkaç döngüsü sırasında floresan sinyali fazla değişmez.Düz bir çizgiye yaklaşmaya taban çizgisi denir, ancak ilk birkaç döngüye yakından bakarsak, aşağıdaki resimde olanların taban çizgisi içinde olduğunu görürüz.

Arka plan Arka plan şu anlama gelir:
reaksiyondaki spesifik olmayan floresan değeri.Örneğin: verimsiz floresan söndürme;veya SYBR Green kullanımı nedeniyle çok sayıda çift sarmallı DNA şablonu.Sinyalin arka plan bileşenleri, Real-Time PCR yazılım algoritması tarafından matematiksel olarak kaldırılır.

Muhabir sinyali
Raportör sinyali, Real-Time PCR sırasında SYBR Green veya floresan etiketli diziye özgü problar tarafından üretilen floresan sinyalini ifade eder.

Normalleştirilmiş Raporlayıcı Sinyali (RN)
RN, raportör boyanın floresan yoğunluğunun pasif referans boyanın her döngüde ölçülen floresans yoğunluğuna bölünmesini ifade eder.

Pasif Referans Boyası
Bazı Gerçek Zamanlı PCR'lerde,floresan boya ROX, floresan sinyalini normalleştirmek için dahili bir referans olarak kullanılır.Hatalı pipetleme, kuyu pozisyonu ve kuyudan kuyuya floresans dalgalanmalarından kaynaklanan varyasyonları düzeltir.

Floresans eşiği (eşik)
arka plan değerinin üzerine ve amplifikasyon eğrisinin plato değerinin önemli ölçüde altına ayarlandı.PCR tespitinin log-lineer aralığını temsil eden amplifikasyon eğrisinin lineer bölgesinde yer almalıdır.PCR'nin log-lineer fazının kolayca tanımlanabilmesi için log-amplifikasyon eğrisi görünümünde eşikler ayarlanmalıdır.Real-Time PCR'de birden çok hedef gen varsa, her hedef için eşik ayarlanmalıdır.Genel olarak, PCR reaksiyonunun ilk 15 döngüsünün floresan sinyali, floresan arka plan sinyali olarak kullanılır ve floresan eşiği, PCR'nin ilk 3 ila 15 döngüsünün floresan sinyalinin standart sapmasının 10 katıdır ve floresan eşiği, PCR amplifikasyonunun üstel fazında ayarlanır.Genel olarak, her aletin kullanımdan önce ayarlanmış bir floresan eşiği vardır.

Döngü Eşiği (CT) veya Geçiş Noktası (CP)
Amplifikasyon eğrisinin eşiği geçtiği döngü (yani, floresan saptamanın önemli ölçüde arttığı nokta).CT bir kesir olabilir ve başlangıç ​​şablonunun miktarı hesaplanabilir.CT değeri, her bir PCR reaksiyon tüpündeki flüoresan sinyali ayarlanan eşiğe ulaştığında yaşanan döngü sayısını temsil eder.Her şablonun CT değeri ile şablonun ilk kopya numarasının logaritması arasında doğrusal bir ilişki vardır;ilk kopya sayısı ne kadar yüksekse, CT değeri o kadar küçük olur ve bunun tersi de geçerlidir.İlk kopya numarası bilinen bir standart kullanılarak standart bir eğri yapılabilir, burada apsis CT değerini temsil eder ve ordinat, ilk kopya numarasının logaritmasını temsil eder.Bu nedenle, bilinmeyen numunenin CT değeri elde edildiği sürece, numunenin ilk kopya sayısı standart eğriden hesaplanabilir.

ΔCT değeri
ΔCT değeri tanımlarhedef gen ile karşılık gelen endojen referans gen CT değeri arasındaki farktemizlik geni gibi ve kullanılan şablon miktarını normalleştirmek için kullanılır:
⇒ΔCT = CT (hedef gen) – CT (endojen referans gen)

ΔΔCT Değeri
ΔΔCT değeri, ilgilenilen bir örneğin (örn. uyarılmış hücreler) ortalama ΔΔCT değeri ile bir referans örneğinin (örn. uyarılmamış hücreler) ortalama ΔΔCT değeri arasındaki farkı tanımlar.Referans numune aynı zamanda kalibrasyon numunesi olarak da adlandırılır ve diğer tüm numuneler, göreli ölçüm için buna göre normalleştirilir:
⇒ΔΔCT = ortalama ΔCT (ilgilenen örnek) – ortalama ΔCT (referans örnek)

Endojen referans genler (endojen referans genler)
Temizlik genleri (temizlik genleri) gibi endojen referans genlerin ekspresyon seviyeleri numuneler arasında farklılık göstermez.Referans genin CT değerlerinin hedef genle karşılaştırılması, hedef genin ekspresyon seviyesinin giriş RNA veya cDNA miktarına göre normalleştirilmesine izin verir (yukarıdaki ΔCT değerleri ile ilgili bölüme bakın).

Aşağıdakiler için doğru olan dahili referans genleri:RNA numunelerinde olası RNA bozunması veya enzim inhibitörlerinin mevcudiyeti ve ayrıca RNA içeriği, ters transkripsiyon verimliliği, nükleik asit geri kazanımı ve numune işlemedeki varyasyonlar.Optimum referans gen(ler)ini seçmek için, algoritmayı, deneysel ayara bağlı olarak optimal referansı seçmesine izin verecek şekilde değiştirdik.

Dahili kontrol
Hedef sekans ile aynı reaksiyonda amplifiye edilen ve farklı bir prob ile problanan (yani, dubleks PCR gerçekleştiren) bir kontrol sekansı.Dahili kontroller genellikle, örneğin hedef dizi saptanmadığında olduğu gibi, başarısız amplifikasyonları dışlamak için kullanılır.
Kalibrasyon Örneği
Bir genin göreli ifade düzeyini belirlemek üzere diğer tüm örnekleri karşılaştırmak için göreli kantifikasyonda kullanılan bir referans örneği (örneğin, bir hücre hattından veya dokudan saflaştırılmış RNA).Kalibrasyon numunesi herhangi bir numune olabilir, ancak genellikle bir kontroldür (örneğin, işlenmemiş bir numune veya deneyin sıfır zamanından bir numune).

Pozitif kontroller
ile kontrol reaksiyonlarını kullanınbilinen miktarlarda şablon.Pozitif kontroller genellikle bir primer setinin veya primer-prob setinin düzgün çalışıp çalışmadığını ve reaksiyonun doğru şekilde ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol etmek için kullanılır.

Şablon Kontrolü Yok (NTC)
Genellikle su ile değiştirilen şablon dışında amplifikasyon reaksiyonunun gerekli tüm bileşenlerini içeren bir kontrol reaksiyonu.NTC kullanımı, reaktif kontaminasyonu veya yabancı DNA'nın neden olduğu kontaminasyonu bulabilir, böylece tespit verilerinin gerçekliğini ve güvenilirliğini sağlar.NTC kontrolünün amplifikasyonu kontaminasyonu gösterir.

RT kontrolü yok (NRT)
RNA ekstraksiyon işlemi, son derece zararlı olan ve veri kalitesini etkileyen suçlu ve qPCR'nin doğal düşmanı olan artık genomik DNA içerebilir, bu nedenle deneyler tasarlanırken, yalnızca RNA tespitini güçlendirmek için tasarlanmalıdır.İki yol vardır, biri intronlar boyunca primerler tasarlamak, diğeri DNA'yı tamamen çıkarmak, hangisi daha iyi, hangisi daha sonra tartışılacak.NTR kontrolü, DNA kirliliğini tespit etmek için sihirli bir aynadır.Amplifikasyon varsa, kirlilik var demektir.

standartlar
Standartlar, standart bir eğri oluşturmak için kullanılan bilinen konsantrasyon veya kopya sayısı örnekleridir.Standardın stabilitesini sağlamak için, gen fragmanı genellikle plazmide klonlanır ve standart olarak kullanılır.

standart eğri
genellikle ikiye katlama oranına göre standart ürünle en az 5 konsantrasyon gradyanına seyreltilir ve CT değeri ve kopya numarasının koordinatlarında 5 nokta çizilir ve standart bir eğri oluşturmak için noktalar bir çizgi oluşturacak şekilde bağlanır.Her standart eğri için geçerliliğinin kontrol edilmesi gerekir.Eğim değeri -3.3 ile -3.8 arasındadır ve her konsantrasyon üç kopya halinde gerçekleştirilir.Diğer noktalardan önemli ölçüde farklı olan noktalar atılmalıdır.Test edilecek numunenin CT değeri standart eğriye getirilir ve test edilecek numunenin ekspresyon seviyesi hesaplanabilir.

Test edilecek numunenin CT değeri standart eğriye getirilir ve test edilecek numunenin ilk kopya sayısı hesaplanabilir.

Verimlilik ve Eğim
Standart eğrinin eğimi, gerçek zamanlı PCR'nin etkinliğini temsil eder.
· -3,322'lik bir eğim, PCR amplifikasyon verimliliğinin 1 veya %100 verimli olduğunu ve PCR ürününün miktarının her döngüde ikiye katlandığını gösterir.
· –3,322'den (örneğin, –3,8) daha düşük bir eğim, bir PCR etkinliğini gösterir
· -3,322'den büyük bir eğim (örneğin, -3,0), PCR verimliliğinin %100'den fazla göründüğünü gösterir, ki bu merak uyandırıcıdır, nasıl olur da bir PCR döngüsü amplifiye edilmiş ürünün iki katından fazlasını üretebilir?Bu durum, PCR reaksiyonunun lineer olmayan fazında meydana gelir, yani büyük miktarda non-spesifik amplifikasyon vardır.

erime eğrisi
qPCR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra PCR ürünü ısıtılır.Sıcaklık yükseldikçe, çift sarmallı amplifikasyon ürünü kademeli olarak eriyerek floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olur.Belirli bir sıcaklığa (Tm) ulaşıldığında çok sayıda ürün eriyecektir.Floresan keskin bir şekilde düşer.Farklı PCR ürünleri, farklı Tm değerlerine ve farklı erime sıcaklıklarına sahiptir, böylece PCR'nin özgüllüğü tanımlanabilir.

Erime eğrisi (türev eğrisi)
Erime eğrisi, PCR ürün parçalarının durumunu daha sezgisel olarak gösterebilen bir zirve haritası oluşturmak için türetilir.Erime sıcaklığı, DNA fragmanının Tm değeri olduğundan, DNA fragmanının Tm değerini etkileyen fragman boyutu, GC içeriği vb. gibi bazı parametreler değerlendirilebilir. Genel olarak konuşursak, primer tasarım ilkelerimize göre,güçlendirilmiş ürünün uzunluğu 80-300bp aralığındadır, bu nedenle erime sıcaklığı 80°C ile 90°C arasında olmalıdır.

Erime eğrisinin yorumlanması: Tek ana pik 80°C-90°C arasında görünüyorsa bu, floresan kantitatif PCR'nin mükemmel olduğu anlamına gelir;ana pik 80°C-90°C arasında görünüyorsa ve çeşitli pikler 80°C'nin altında görünüyorsa, temel olarak primer dimer dikkate alınır.Çözmek için tavlama sıcaklığını artırmayı deneyebilirsiniz;ana pik 80°C-90°C arasında görünüyorsa ve muhtelif pik sıcaklık yükseldiğinde tekrar görünüyorsa, temelde DNA kontaminasyonu olduğu kabul edilir ve deneyin başlangıç ​​aşamasında DNA'nın uzaklaştırılması gerekir.

Tabii ki, aşağıda tek tek incelenecek olan bazı anormal durumlar var.
3. Gelişmiş bilgi

qPCR yapmak için MIQE demeliyim,Minimum BilgiYayın içinNicelGerçek Zamanlı PCRDeneyler — gerçek zamanlı kantitatif PCR hakkında makaleler yayınlamak için gereken minimum bilgilerdeneylerHerkesin anlayışını basitleştirmek için temel içeriği basitleştireceğiz.

MIQE'nin orijinal metnini internette aratabilirsiniz ve en önemlisi,bir makale yayınlanırken sağlanması gereken veri kontrol listesi .

Gözden geçirenler, bu ayrıntıları okuyarak deneyin kalitesini değerlendirebilir;gelecekteki okuyucular bunu deneyi tekrarlamak veya geliştirmek için de kullanabilir.
Bu listede, her listenin öneminin sırasıyla E veya D ile işaretlendiğini belirtmekte fayda var.Bu ne anlama geliyor?E: gerekli bilgiler (gönderilmelidir);D: istenen bilgi (mümkün olduğu kadar çok bilgi verin).

MIQE (1)—Deneysel Tasarım
Lisansüstü eğitimlerini bitirdikten sonra savunmalarını tamamlayan birçok pislik, bağımsız olarak deney tasarlamayı, defterlerini açmayı ve öğretmenin onlara yapmalarını söylediği şeyi yapmayı bilemeyecek.Sonuç olarak, deneysel tasarım titiz değildi ve derginin yazı işleri, bu resmi ve bu resmi uydurmak istediklerini söylediler, bu yüzden şaşkınlıkla yaptılar.İşte pislikler böyle yapılır!

Eve daha yakın, deneyin ilk ilkesi belirlemektirdeneysel mantığın titizliği.En temel şey deneysel tasarımdır ve deneysel tasarımla ilgili en önemli şey, deneysel verilerin referans alınabilmesi, karşılaştırılabilir ve ikna edici olabilmesi için hedef örneğin, referans örneğin (kontrol) ve tekrar sayısının nasıl belirleneceğidir.

hedef örnekbelirli bir tedaviden sonra hedef geni tespit etmemizi gerektiren numuneyi ifade eder.referans örneğibiyolojide genellikle vahşi tip olarak adlandırılan herhangi bir işlem görmemiş numunedir.

Deneysel kopyalarçok önemlidir.Genel olarak, ikna edici kopyaların sayısı üçten fazla olmalıdır.Neyin biyolojik replikasyon olduğunu ve neyin teknik replikasyon olduğunu ayırt etmek gerekir.

Biyolojik Kopyalar: Farklı malzemelerle (zaman, tesisler, partiler, reaksiyon plakaları) yapılan aynı doğrulama deneyi.

Biyolojik çoğaltma
Örnek olarak biberin böcek ilacı tedavisini ele alalım.ABC'nin üç bitkisine böcek ilacı püskürtmek istiyoruz, o zaman ABC'nin üç bitkisi üç biyolojik kopyadır ve bunlar farklı malzemelerle gerçekleştirilen aynı doğrulama deneyidir.Ancak bir deney olarak, kesinlikle bir kontrole ihtiyaç vardır, bu nedenle A bitkisinin bir deney grubunu oluşturmak için A bitkisinin dallarından birini püskürtebiliriz ve bir kontrol grubu oluşturmak için A bitkisinin diğer dallarını püskürtmeyebiliriz.B ve C için de aynısını yapın.

Teknik Kopyalar (Teknik Kopyalar): Aslında aynı malzemede bulunan bir çift delik olan işlemden kaynaklanan hataları önlemek için tasarlanmış tekrarlanan bir deneydir.Hem tedaviler hem de kontroller, hedef genin ve dahili referans genin kopya ayarlarına (minimum üç) sahip olmalıdır.

teknik tekrar
Yine böcek ilacı ile işlenmiş biberi örnek olarak alın.A bitkisinin deney grubu için, tespitten sonra ortalamayı almak üzere hedef geni ve dahili referans geni için sırasıyla 1, 2 ve 3 olmak üzere üç PCR deliği açtık.Bitki A Gruplarının kontrolü için de aynı şekilde muamele edilir.Benzer şekilde, B ve C bitkileri için aynı muameleyi yapın.Bu teknik bir tekrardır.

şunu belirtmekte fayda varistatistiğe giren şey biyolojik tekrardır ve teknik tekrar, deneysel sonuçları inandırıcı kılmak, yani sık sık söylediğimiz gibi ortalamalarını alarak hatalardan kaçınmak için deneysel süreçte herhangi bir rastgele fenomen olup olmadığını test etmektir.

Negatif Kontroller—NTC ve NRT
NTC (Şablonsuz Kontrol), deney malzemesinin kontamine olup olmadığını doğrulamak için şablonu olmayan bir kontrol kullanılır.Kalıp olarak genellikle su kullanılır.Bir floresan reaksiyonu varsa, laboratuvarda nükleik asit kontaminasyonunun meydana geldiğini gösterir.

Bu kirlilikler şunlardan kaynaklanır: saf olmayan su, endojen DNA içeren vasıfsız reaktifler, primer kirliliği, laboratuvar ekipmanı kirliliği, aerosol kirliliği, vb., RNaz temizleyicileri ve RNaz inhibitörlerini kullanma ihtiyacı.Aerosol kirliliği, bulunması en zor olanıdır.Laboratuvarınızın havada asılı duran çeşitli nükleik asitlerle sis gibi olduğunu hayal edin.

NRT (No-Reverse Transkriptaz), ters transkripsiyonu olmayan kontrol, gDNA kalıntısının kontrolü olan negatif kontrol olarak ters kopyalanmamış RNA'dır.

Gen ifadesi yapılırken ters transkripsiyon sonrası cDNA miktarı saptanarak RNA miktarı tespit edilir.RNA saflaştırıldığında gDNA kalıntısı varsa, elde edilen gerçek sonuçlar gDNA ve cDNA olduğu için deneysel sonuçlarda hatalara neden olur.Toplam düzeyde, sadece cDNA değil, RNA ekstraksiyonu sırasında gDNA'nın tamamen çıkarılması gerekir.

MIQE (2)—örnek bilgi
Numune bilgisi denilen şey, qPCR ile ilgili bir makale yayınladığımızda, makalenin vazgeçilmez bir parçası olan numune bilgilerini net bir şekilde açıklamamız gerektiği anlamına gelir.Benzer şekilde, numuneleri işlerken, numunelerin geçerliliğini sağlamak için kendi işlemlerimizi de düzenlememiz gerekir.

Numunenin açıklaması sadece bir sonuçtur ve tüm deney boyunca alınan malzemelere daha fazla dikkat etmeliyiz.

Deneysel materyallerin seçimi
Kan örnekleri – en fazla 4 saat taze kan seçin.Hücre örnekleri – güçlü bir büyüme döneminde taze hücreleri toplamayı seçin.Hayvan Dokusu—Taze, hızla büyüyen dokuyu seçin.Bitki Dokusu – Taze, genç dokuyu seçin.

Bu birkaç cümlede bir anahtar kelime olduğunu fark etmişsinizdir: taze.
Yukarıdaki örnekler için, piyasadaki en iyi, uygun maliyetli ve kararlı kit, DNA ve RNA'larını hızlı ve kolay bir şekilde çıkarabilen Foregene kitidir.

Kan DNA Mini Kiti

Hücre Toplam RNA İzolasyon Kiti

Hayvan Total RNA İzolasyon Kiti

Bitki Toplam RNA İzolasyon Kiti

Bitki Total RNA İzolasyon Kiti Plus

Bitki DNA İzolasyon Kiti

Deneysel materyallerin saklanması
Genel olarak konuşursak, koşullar izin veriyorsa numunelerin saklanmasını önermiyoruz.Ancak numune aldıktan hemen sonra deney yapamayan birçok arkadaş var, hatta bazıları numune almak için sahaya sıvı nitrojen tankları taşımak zorunda kalıyor.

Bu tür çalışkan bir arkadaş için sadece reaktif sarf malzemelerinden anlamadığınızı söyleyebilirim.Artık birçok reaktif sarf malzemesi şirketi, RNA örneklerini oda sıcaklığında saklayabilen reaktifler üretiyor ve bunları kullanmayı seçebilirsiniz.Geleneksel depolama yöntemi, taşıması kolay küçük bir sıvı nitrojen tankı kullanan sıvı nitrojen depolamadır.Numuneyi laboratuvara geri getirdikten sonra -80°C buzdolabında saklayın.

RNA içeren deneyler için altı kelimelik ilke izlenmelidir:düşük sıcaklık, enzim yok,Vehızlı .

Düşük sıcaklık kavramının anlaşılması kolaydır;enzimler olmasaydı, RNaz yaşadığımız dünyanın her yerinde bulunur (aksi takdirde HIV tarafından öldürülürdünüz), dolayısıyla deney yaparken RNaz'dan nasıl kaçınılacağı çok önemli bir kavramdır;hızlı,Dünyada kırılamayan Kung Fu yoktur, sadece hız kırılamaz.

Bu nedenle, bir anlamda, ekstraksiyon süresi ne kadar kısaysa, kit o kadar iyi olur.nedenforegene' nin kiti hızı vurguluyor çünkü bunu iyi biliyorlar.

Not: Bazı kızlar deneyleri çok dikkatli yaparlar, ancak birkaç yıl çalıştıktan sonra smaç kadar iyi değiller.Tanrı'nın adaletsiz olduğunu düşünürler, başkaları hakkında şikayet ederler ve hayat ararlar.Aslında, anlamadı.RNA'yı iyi korumadı ve smaç oyuncusu çevikti.Deneyi yaparken smacı üç kez, beş kez ve iki tümen ile bitireceğini düşündü ama deneyi iyi yaptı.

Not: Daha yavaş, daha fazla RNase istilası şansı.Hızlı olmak için kendinizi nasıl eğitirsiniz?Başka yolu yok, sadece daha fazla pratik yap.

Farklı deneyler ve farklı örnekler için, daha fazla literatür okumak ve işleme için uygun bir yöntem seçmek hala gereklidir.Numune toplama ve saklama süreci için MIQE, makaleye açıkça yazılmasını gerektirir, böylece hakemler makalenin güvenilirliğini gözden geçirebilir ve aynı zamanda sersemlemiş gençlerin deneyinizi tekrar etmesi uygundur.

Biyolojik deneyler zor olsa da, üst düzeydir.Dikkatli olmazsan dünyayı alt üst edebilirsin.Örneğin, SARS'ı biyokimyasal bir krize dönüştürmek veya 1,3 milyar insanı kurtarmak için hibrit pirinç yapmak.Aşağıdaki resim bir kimyasal deney, araştırmanızla ne kadar gurur duyduğunuzu sadece onun sikimsi görünümüne bakarak anlamalısınız.Unut gitsin, onu karalama.

MIQE (3) – nükleik asit ekstraksiyonu.
Nükleik asit ekstraksiyonu büyük bir olaydır ve tüm moleküler biyoloji deneyleri nükleik asit ekstraksiyonu ile başlar.Öncelikle MIQE'nin içeriğini nükleik asit ekstraksiyonu üzerine kopyalayalım.

Bu forma baktığınızda, yüzeyde kalamazsınız.Biçim bir dogmadır.En iyi öğrenci olmak için nedenini sormalısın.Bu tablonun temel içeriği şudur: TakipRNA'nın saflığı, bütünlüğü, tutarlılığı ve ekstraksiyon miktarı .

ilk bölümüişlem veya araç, nükleik asit ekstraksiyon adımıdır.Ekstraksiyon için otomatik bir nükleik asit ekstraktörü kullanıyorsanız (gelişmiş, lütfen satın almak için benimle iletişime geçin), cihazın model adını belirtmeniz gerekir.

Setin adı ve

değişim detayları için hangi kitin kullanıldığı, hangi özel reaktiflerin eklendiği veya hangi özel işlemlerin yapıldığı net bir şekilde anlatılmalı ki başkaları da deneyinizi kolayca tekrar edebilsin.

Bazı insanlar, özel numuneleri çıkarırken, bunun kendi gizli silahları olduğunu düşünerek bazı özel reaktifler ekler ve başkalarına söylemezler.Gizli tutarken, makalenizin parlamasını sağlama fırsatını da kaybederler.Zeki olmayın, bilimsel araştırmalarda taşralı yaşlı Zhang'dan daha dürüst olmalısınız, zeki olmak istiyorsanız makale sizi aptal yerine koyar.

kitin ürün numarasını hatırlamalıKiti sipariş ettiğinizde ve makaleyi yazdığınızda.Kit üzerinde genellikle iki numara bulunur: Cat—katalog numarası (ürün numarası, ürün numarası), Lot—ürün lot numarası ( Ürünün hangi partiden geldiğini belirtmek için kullanılır).

Ek olarak, biyokimyasal reaktifler sipariş edilirken genellikle CAS numarası kullanılır ve onu birlikte yaygınlaştıracağım.CAS numarası, American Chemical Society tarafından her yeni kimyasal ilaca verilen numaradır.Genel olarak, üç sayı bir tire ile bağlanır.Rushui'nin CAS numarası: 7732-18-5.Kimyasalların çoğu zaman birden çok takma adı vardır, ancak CAS numarası benzersizdir.İlaç siparişi verirken öncelikle CAS numarasını kontrol edebilirsiniz.

Eve daha yakın, neden bunları net bir şekilde tanımlamamız gerekiyor?Aslında, RNA ekstraksiyonunun kalitesini de kontrol etmektir.Aletlerin ve kitlerin kullanılması, RNA ekstraksiyonunu daha tutarlı hale getirecektir.Sıradan laboratuvarların ekstraksiyon ölçeği büyük değildir ve kitlerle elde edilebilir.

DNaz veya RNaz tedavisinin ayrıntıları
Floresan kantitatif PCR'nin önemli konusu, DNA kontaminasyonunu önlemek ve kontaminasyon varsa deney yapmamaktır.Bu nedenle, deneysel süreçte DNA'nın tamamen ve tamamen çıkarıldığını göstermek için, DNA'yı işlemek için kullandığınız işlemi belirtmek zorunludur.şematik bir diyagramla temsil edilir.

RNA ve DNA'nın şematik diyagramı
Genel olarak, DNA'yı çıkarma yöntemi, ekstraksiyondan sonra RNA'yı DNaz ile işlemektir.Ancak bunlar nispeten eski yöntemlerdir.Ticari RNA ekstraksiyon kitleri, ekstraksiyon işlemi sırasında DNaz eklemeden DNA'yı çıkarabilmiştir.Örneğin, Foregene'den bir dizi kit .

Not: RNA ekstraksiyonu sırasında DNA'nın çıkarılması, RNA ekstraksiyonunun çalışma süresini uzatacak ve RNA bozulması riskini artıracak çok tehlikeli, iki ucu keskin bir kılıçtır.Temel olarak, RNA verimi ve saflık arasında bir değiş tokuştur.

Ayrıca silika bazlı adsorpsiyon kolonuna eklenen DNaz miktarı çok azdır ve etkiyi elde etmek için yüksek kaliteli DNaz kullanılmalıdır.Optimize edilmemiş DNase hızlı ve tamamen sindirilemez.Bu, tüccarın teknik seviyesinin bir testidir.Elbette, DNA'nın DNaz olmadan çıkarılabileceğiyle övünen daha da garip tüccarlar var.DNA'nın DNaz olmadan tamamen çıkarılabileceğiyle övünen herkesin bir holigan olduğu söylenebilir.DNA nispeten kararlı, çift sarmallı bir yapıdır ve sadece konuşarak ve gülerek yok edilemez.

kontaminasyon değerlendirmesi
değerlendirme yöntemi: elektroforez tespiti, %1 agaroz, 6V/cm, 15dk, yükleme 1-3 ul

Nükleik asit kantitatif analizi
genellikle bir UV spektrofotometre kullanılarak ölçülür.Önce OD260, OD280 ve OD230'un üç değerinin anlamını popülerleştirmeme izin verin.
·OD260nm: Nükleik asidin en yüksek absorpsiyon zirvesinin absorpsiyon dalga boyu olup, ölçülen en iyi değer 0,1 ile 1,0 arasındadır.Değilse, aralığın içine getirmek için numuneyi seyreltin veya konsantre edin.
·OD280nm: Protein ve fenolik maddelerin en yüksek absorpsiyon pikinin absorpsiyon dalga boyudur.
·OD230nm: Karbonhidratların en yüksek absorpsiyon zirvesinin absorpsiyon dalga boyudur.

Ardından, her bir göstergenin rolü hakkında konuşalım.A260 için, nükleik asit verimini ölçmek için kullanılabilir.OD260=1 olduğunda, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Saflık için yaygın olarak gördüğümüz oranlara bakmamız gerekiyor: OD260/280 ve OD260/230.
·Saf DNA: OD260/280, yaklaşık olarak 1,8'e eşittir.1,9'dan büyük olması RNA kirliliği olduğunu, 1,6'dan küçük olması protein ve fenol kirliliği olduğunu gösterir.
·Saf RNA: 1.7
·OD260/230: İster DNA ister RNA olsun, referans değeri 2,5'tir.2.0'ın altında ise şeker, tuz ve organik madde kirliliği olduğunu gösterir.

RNA bütünlüğü

RNA'nın bütünlüğünü ölçmek çok önemlidir.Genel olarak, 28S ve 18S RNA arasındaki parlaklığın iki katlı bir ilişki olup olmadığını kontrol etmek için bir RNA denatürasyon jeli deneyi yapmak gerekir.Üçüncü bant 5S göründüğünde, omurgasızlar hariç RNA'nın bozulmaya başladığı anlamına gelir.

RNA kalite değerlendirmesi için veriler: Yukarıdaki testlere ek olarak, Experion otomatik elektroforez sisteminin RNA'nın görünmez bir şekilde bozulup bozulmadığını tespit edebilen RQI bütünlük testi gibi, RNA bütünlüğü açısından bazı daha gelişmiş cihaz testleri de vardır.

Bilimsel araştırmalarda floresan kantitatif PCR, hedef gen ile dahili referans gen arasındaki bir karşılaştırmadır.Bu nedenle, RNA örneğinin korunması, RNA ekstraksiyonu vb. sürecinde birincil amaç, RNA'nın bütünlüğünü sağlamaktır.

RNA'nın bütünlüğünün hedef gen ile iç referans gen arasındaki dengeyi nasıl etkilediği aşağıdaki şekilden kolayca anlaşılabilmektedir.Bozulma, gen eksikliğine yol açacaktır, ister dahili referans geninin eksikliği, ister hedef genin eksikliği, veriler üzerinde büyük bir etkisi olacaktır.

Hedef genin ve referans genin şematik diyagramı doğru olmamalıdır

İnhibisyon testi (CT değerinin yüksek veya düşük konsantrasyon veya diğer koşullar altında bastırılıp bastırılmadığı)

Bu rakamı örnek alarak, beş eğrinin Ct değerleri aşağıdaki gibidir.CT değerlerinin eğriler arasındaki dağılımı düzensizdir ve PCR inhibisyonunda olduğu gibi yüksek ve düşük konsantrasyonlarda Ct değerleri gecikir.

Anahtar nokta: RNA ekstraksiyonu sürecinde, kavram yanılgılarını terk etmemiz ve doğru olanları oluşturmamız gerekiyor.

Yanlış fikir şudur: RNA ekstraksiyonu, elde edilen RNA miktarı ne kadar büyük olursa o kadar iyi olduğunu düşünerek yalnızca verimi takip eder.Aslında kantifikasyon yaptığımızda eğer gen sayısı çok fazla değilse çok fazla RNA'ya ihtiyacımız yok.Çıkardığınız RNA miktarı fazlasıyla yeterli.

Doğru kavram şudur:RNA ekstraksiyonu saflık, bütünlük ve tutarlılık sağlamalıdır..Saflık, sonraki ters transkripsiyonun engellenmemesini ve verilerin DNA'dan etkilenmemesini sağlayabilir.Bütünlük, hedef dizilerin ve dahili referansların dengesini sağlar.Tutarlılık, kararlı örnek yükleme sağlar.

MIQE (4) – ters transkripsiyon
Yanlış kanı: daha yüksek numune hacmi arayışı.
Doğru konsept: Takip tutarlılığı (stabilite), yüklenen RNA miktarına bakılmaksızın, ters transkripsiyonun etkinliği tutarlı kalır ve cDNA'daki farklılıkların mRNA'daki farklılıkları gerçekten yansıtabilmesini sağlar.
Bu süreci şematik bir diyagramla açıklıyoruz:

Ters transkripsiyon verimliliğinin şematik diyagramı, doğru değil
Öncelikle ters transkripsiyon işlemi ile PCR işlemi arasındaki farkı anlamamız gerekiyor.PCR, çoklu ısıtma ve tavlama işlemlerinden geçer ve hedef fragman katlanarak büyür;revers transkripsiyonda bu süreç yokken, revers transkripsiyonun aslında bire bir olduğunu düşünebiliriz.

cDNA Bilgisi kadar çok parça alınabileceği için, şimdiye kadar anlaşılmalıdır, çünkü büyük ve küçük parçalar ters kopyalanmıştır ve tek bir parçaya odaklanmak imkansızdır.Ve RNA miktarı nispeten küçük olduğundan, elde edilen cDNA miktarı da amplifikasyon etkisine sahip PCR'den farklı olarak nispeten küçüktür, bu nedenle tespit edilmesi temelde imkansızdır.

cDNA elektroforez sonuçları
İkincisi, ideal olarak, ters transkripsiyon bire bir yapılır, ancak hiçbir şirketten hiçbir ters transkriptaz bu etkiyi sağlayamaz.Temel olarak, çoğu ters transkriptazın etkinliği %30-50 arasında gezinir.Durum buysa, şekilde görmek istediğimiz şey olan nispeten kararlı bir ters transkripsiyon etkinliğine sahip olmayı tercih ederiz: 3 RNA 2 cDNA alır, 6 RNA 4 cDNA alır, yani ne kadar örnek yüklenirse yüklensin, ters transkripsiyon verimliliği nispeten kararlıdır.Ters transkripsiyon verimliliğinin kararsız olduğu ve yüksek konsantrasyonun engellendiği bir durumu görmek istemiyoruz.

Peki, ters transkripsiyon verimliliğinin kararlı olup olmadığı nasıl doğrulanır?Yöntem çok basit, sadece bir karşılaştırma testi yapmanız gerekiyor: biri RNA'nın iki katına seyreltilmesinden sonra cDNA'ya ters transkripsiyon yapmak, diğeri ise cDNA'ya ters transkripsiyondan sonra ikiye katlama seyreltmesi yapmak ve ardından elde edilen eğimin tutarlı olup olmadığını görmek için qPCR yapmak.Başarılı bir öğrenci olarak bunu saniyeler içinde anlamalısınız.Aşağıda gösterildiği gibi:

Ters transkripsiyonun etkinliğinin kararlı olup olmadığını test etmek için RNA ve cDNA'nın seyreltilmesi
Ters transkriptaz ve kiti
Mükemmel floresan kantitatif PCR nasıl mükemmel ters transkriptaz ve kite sahip olabilir?Ters transkriptaz, kaynağa göre kabaca iki tipe ayrılır, AMV veyaM-MLVve performansları tabloda gösterilenle aynıdır.

RNase H aktivitesi
RNaz H, Ribonükleaz H'dir, Çince adı, DNA-RNA hibrit zincirinde RNA'yı spesifik olarak hidrolize edebilen bir endoribonükleaz olan ribonükleaz H'dir.RNase H, tek sarmallı veya çift sarmallı DNA veya RNA'daki fosfodiester bağlarını hidrolize edemez, yani tek sarmallı veya çift sarmallı DNA veya RNA'yı sindiremez.cDNA'nın ikinci sarmalının sentezinde yaygın olarak kullanılır.

Bu garip bir şey.Ters transkriptazın RNaz H aktivitesine sahip olduğunu söylüyoruz, ters transkriptazın RNaz H içerdiğini değil ve RNaz H'yi ters transkriptazdan ayırmak mümkün olmayabilir, belki de ters transkriptazdaki bazı grupların konformasyonundan dolayı Bu aktiviteye ters transkriptaz neden olur.

Bu nedenle, AMV'nin daha yüksek ters transkripsiyon verimliliğine bakılmaksızın, RNaz H aktivitesi, cDNA'nın verimini azaltır.Elbette reaktif üreticileri, cDNA verimini artırmak için ters transkriptazdaki RNase H aktivitesini mümkün olduğunca ortadan kaldırmak için ürünlerini sürekli olarak optimize etmektedirler.
tavlama sıcaklığı

Farklı sıcaklıklarda RNA'nın ikincil yapısı
Farklı sıcaklıklarda RNA'nın ikincil yapısı için yukarıdaki şekle bakın ve belirli sıcaklık ve tuz konsantrasyonu koşulları altında hedef parçanın ikincil yapısını belirlemek için mFold çevrimiçi aracını kullanın.55°C'de RNA'nın ikincil yapısı hala çok karmaşıktır, revers transkriptaz çalışamaz ve 65°C'ye kadar ikincil yapı tam olarak çözülemezken, AMV ve M-MLV'nin optimum sıcaklığı bu sıcaklıktan çok daha düşüktür.
ne yapalım?İkincil yapı, şablonun kendisinin tamamlayıcı eşleşmesidir; bu, primer ve ters transkriptaz ile şablon arasında güçlü bir rekabete yol açar ve düşük E ve zayıf tekrarlanabilirlik gibi bir dizi sorunla sonuçlanır.

ne yapalım?Sadece tavlama sıcaklığını mümkün olduğu kadar arttırın.

Birçok reaktif üreticisi, genetik mühendisliği yoluyla ters transkriptazlarını geliştirmektedir.Jifan ve Aidelai gibi bazıları reaksiyon sıcaklığını arttırır ve bazıları enzim ile RNA şablonu arasındaki afiniteyi artırmak için RNase H enziminin aktif grubunu çıkarır.Yüksek afinite, ikincil yapıyı rekabetçi bir şekilde sıkıştırabilir ve sorunsuz bir şekilde okuyabilir ve ayrıca ters transkripsiyonun etkinliğini büyük ölçüde artırabilir.
Anahtar nokta: Ters transkripsiyon, özellikle büyük ölçekli bir floresan kantitatif PCR değilse, yüklenen numune miktarından ziyade ters transkripsiyon etkinliğinin tutarlılığını sürdürmek için daha önemlidir (enzimler sadece verimli değil, aynı zamanda kararlı da olmalıdır), bu hiç mümkün olmayacaktır.Çoklu cDNA'lar.
Çeşitli üreticiler de tutarlılık arayışında bazı çabalar sarf ettiler.Örneğin, çoğu şirket artık ters transkripsiyonu satış için standart bir kit olarak paketliyor ve bu iyi bir seçim.
Örneğin, Foregene'nin RT Easy Serisi kitleri:

RT Easy I(İlk iplikçik cDNA sentez kiti için ana ön karışım)

MIQE (5) – hedef gen bilgisi

Yukarıdaki şekil açıklıyor
1. Bu genin tekrarlanan deneyler için etkili olup olmadığı genellikle tekrarlanan deneylerle doğrulanabilir.
2. Gen Kimliği, bilirsiniz.
3. Gen uzunluğu, hedef genin toplam uzunluğu kesinlikle sorun değildir.Primerleri tasarlarken, daha iyi amplifikasyon verimliliği sağlamak için amplikon uzunluğunun 80-200bp arasında olduğundan emin olun.
4. Sekans Blast karşılaştırma bilgisi, spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek için hedef genin gen bankasında karşılaştırılması gerekir.
5. Sözde genlerin varlığı.Bir sözde gen, normal bir gene benzer bir DNA dizisidir, ancak normal işlevini kaybeder.Genellikle çok genli ökaryot ailesinde bulunur.Genellikle ψ ile temsil edilir.Kodlayan gen dizisine çok benzeyen genomdaki işlevsel olmayan bir genomik DNA kopyasıdır., genellikle kopyalanmaz ve net bir fizyolojik anlamı yoktur.
6. Primerlerin eksonlara ve intronlara göre konumu.İlk yıllarda, DNA kontaminasyonu problemini çözdüğümüzde, genellikle primerlerin, ekzonların ve intronların konumlarına dikkat ettik ve genellikle DNA amplifikasyonunu önlemek için intronlar boyunca primerler tasarlamayı düşündük.Lütfen aşağıdaki şekle bakın: siyah intronları, çeşitli maviler ekzonları, pembe ortak primerleri ve parlak kırmızı intron kapsayan primerleri temsil eder.

Şematik, asla doğru değil
Bu ne kadar mükemmel bir plan gibi görünüyor, ama aslında çoğu durumda trans-intron primerleri sanıldığı kadar büyülü değiller ve aynı zamanda spesifik olmayan amplifikasyona da neden olacaklar.Bu yüzden DNA kontaminasyonunu önlemenin en iyi yolu DNA'yı tamamen çıkarmaktır.
7. Konformasyon tahmini.Bu örneği tekrar kullanarak, belirli bir sıcaklıkta ve tuz konsantrasyonunda hedef parçanın ikincil yapısını belirlemek için mFold çevrimiçi aracını kullanın.

Farklı sıcaklıklarda RNA'nın ikincil yapısı
İkincil yapı, şablonun tamamlayıcı eşleşmesidir, bu da primer ve şablon eşleşmesi arasında güçlü bir rekabete yol açar ve primer bağlanma şansı daha azdır, bu da düşük E ve zayıf tekrarlanabilirlik gibi bir dizi soruna yol açar.Yazılım tahmini sayesinde, ikincil yapı sorunu yoksa, bu harika olur.Varsa, takip makalemiz bu sorunun nasıl çözüleceğini özel olarak tartışacaktır.

MIQE (6)—qPCR Oligonükleotitler

Floresan kantitatif PCR için, her gün uğraştığınız ilk şey RNA ekstraksiyonudur ve ikincisi, primer tasarımı olabilir.
Öncelikle yine MIQE kontrol listesine göre astar tasarımı ile ilgili kuralları kontrol ediyoruz.O kadar basit ki, pislikler gülebilir ve bunu bir cümleyle bitirebiliriz: Primer sondanın sırasını ve konumunu ve modifikasyon yöntemini öğrenin.Primer saflaştırma yöntemi için primer sentezi şu anda çok ucuz, qPCR PAGE ve üzeri saflaştırma yöntemlerine yakışır ve sentez aletinin bilgisi önemli değil.Birçok kişi on yıllardır primerler yapıyor ve sentezleyicinin ABI3900 olduğunu bilmiyor.
Astar tasarımının ilkeleri ile ilgili olarak, bunları ezberlemek zorunda değilsiniz, çünkü çoğu astar tasarım yazılımı veya çevrimiçi araç bu sorunları çözebilir (önerilen çevrimiçi araç primer3.ut.ee/) ve astar tasarımının %99,999'u manuel olarak yapılmaz Bakın, yazar bazen günde yüzlerce astar tasarlar, tek tek okursanız şaşı olur.
Astarlar tasarlandıktan sonra aşağıdaki noktaları kontrol etmeniz yeterlidir:
1. Primerleri 3' uca yakın tasarlayın: cDNA birinci iplikçik sentezi için oligo dT primerlerinin kullanılması durumunda, ters transkripsiyon etkinliği ve RNA bütünlüğü göz önüne alındığında, amplifikasyon verimliliğini artırmak için tasarlanan primerlerin 3' uca yakın tasarlanması gerekir.Aşağıdaki şekilde açıklamak için bir resim kullanın (bunu anlamanın hiçbir yolu yok):

Primerler neden 3' ucuna yakın tasarlanmalı, bu doğru olmamalı
2. TM değeri: Tm değeri 55-65°C'de (çünkü ekzonükleaz aktivitesi 60°C'de en yüksek) ve GC içeriği %40-%60'ta.
3. BLAST: Genomun spesifik olmayan amplifikasyonunu önlemek için, tamamlayıcı doğrulama için Blast kullanılmalıdır.

MIQE(7)—qPCR işlemi

1. qPCR kiti
MIQE gerekliliklerine göre, PCR reaksiyon sisteminin konfigürasyonu, hangi kitin kullanıldığı, üreticisinin kim olduğu, reaksiyon sisteminin ne kadar büyük olduğu, boya yönteminin mi yoksa prob yönteminin mi kullanıldığı, PCR program ayarları dahil olmak üzere, makaledeki tüm reaksiyon koşullarını açıkça anlatmalıyız.Kıdemli sürücüler, kit seçildiği sürece, yukarıdaki bilgilerin temel olarak belirlendiğini kesinlikle görecektir.
Şu anda, floresan kantitatif PCR kitlerinin üretimi ve üretimi çok olgun bir teknolojidir.Aşırı derecede kötü üreticiler seçmediğiniz sürece sorun çıkma olasılığı yüksek değil ancak yine de birkaç noktayı sizlerle paylaşmak istiyoruz:
Hot-start Taq enzimi:PCR'nin en önemli kısmı, sıcak başlangıçlı Taq enzimidir.Piyasadaki hot-start enzimleri genel olarak iki türe ayrılır, biri kimyasal olarak modifiye edilmiş hot-start enzimi (parafine gömülme olarak düşünebilirsiniz), diğeri ise antikor modifikasyonu (antijen-antikor bağlama) için hot-start enzimidir.Kimyasal modifikasyon, sıcak başlangıçlı enzimlerin erken bir yoludur.Belirli bir sıcaklığa ulaşıldığında, enzim aktivitesini serbest bırakır.Antikorla modifiye edilmiş sıcak başlatma enzimi, enzimin aktivitesini bloke etmek için biyolojik yöntemler kullanır.Belirli bir sıcaklığa ulaşıldığında, antikor denatüre olacak ve bir protein olarak inaktive edilecek ve enzim aktivitesi devreye girecektir.

Ancak bunun ne faydası var?Bu durumda, antikorla modifiye edilmiş enzimlerin salma aktivitesi kimyasal olarak modifiye edilmiş enzimlerden daha hızlıdır, bu nedenle duyarlılık açısından antikorla modifiye edilmiş enzimlerin hafif bir avantajı vardır, bu nedenle temelde piyasadaki kitlerde kimyasal olarak modifiye edilmiş enzim yoktur.Eğer varsa, o zaman bu üreticinin teknolojisi milenyum çağına takılıp kalmıştır.
Magnezyum iyonu konsantrasyonu:Magnezyum iyonu konsantrasyonu PCR reaksiyonunda çok önemlidir.Uygun magnezyum iyonu konsantrasyonu, Taq enzim aktivitesinin salınmasını teşvik edebilir.Konsantrasyon çok düşükse, enzim aktivitesi önemli ölçüde azalır;konsantrasyon çok yüksekse enzim katalizli non-spesifik amplifikasyon artacaktır.Magnezyum iyonlarının konsantrasyonu ayrıca primerlerin tavlanmasını, şablonun ve PCR ürünlerinin erime sıcaklığını etkileyerek amplifiye fragmanların verimini etkiler.Magnezyum iyonlarının konsantrasyonu genellikle 25 mM'de kontrol edilir.Elbette iyi bir kit için magnezyum iyonlarının konsantrasyonunun iyi kontrol edilmesi gerekir.Bazı tüccarlar, reaktife, magnezyum iyonu konsantrasyonunun otomatik olarak ayarlanması etkisini elde edebilen bir magnezyum iyonu şelatlama maddesi ekler.
Floresan boya konsantrasyonu:Genellikle kullandığımız SYBR Green olan flüoresan boya, esasen çift sarmallı DNA'nın küçük oluğuna bağlanarak flüoresan üretir, çünkü boyanın çift sarmallı DNA'ya bağlanması spesifik değildir, yani çift sarmallı DNA onunla birleştiği sürece flüoresan oluşabilir, bu nedenle sistemdeki primer-dimerler ve DNA şablonları bununla birleşerek bir arka plan sinyali oluşturur.
Not: Işığa duyarlı özelliğinden dolayı piyasadaki ürünler genellikle kahverengi opak santrifüj tüplerinde (aşağıdaki resimde gösterildiği gibi) ambalajlanmaktadır.Ancak bu bir sorunla karşılaşacaktır.Numune alırken sıvının emilip emilmediğini görmek zordur.Bu açıdan, Qingke gerçekten de en kullanıcı dostudur (aşağıdaki resimde gösterildiği gibi) ve şeffaf tüp, opak bir teneke torba içinde paketlenmiştir.Daha sonra ışıktan kaçınma ve numune alma kolaylıklarını göz önünde bulundurarak teneke bir torbaya koyun.Doğru ürün numarasını seçmelisiniz.TSE204, çim dikmek istememe neden olan süper uygun maliyetli bir varlıktır.

Floresan boyanın konsantrasyonu da çok önemlidir.Konsantrasyon çok düşükse amplifikasyon eğrisi sonraki aşamada yükselmez ve mükemmel olmaz;konsantrasyon çok yüksekse, gürültü girişimine neden olur.Floresan kantitatif PCR esas olarak CT değerine bağlı olduğundan, floresan boyanın konsantrasyonu düzgün ayarlanmazsa, düşük nokta yüksek noktadan daha iyidir.Tabii ki, uygun boya konsantrasyonu en iyisidir.

ROX: ROX boyaları kuyudan kuyuya floresan sinyal hatalarını düzeltmek için kullanılır.Bazı cihaz üreticileri kalibrasyon gerektirirken diğerleri gerektirmez.Örneğin, Thermo Fisher Scientific'in Real Time PCR amplifikasyon cihazının kullanımı genellikle 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus vb. dahil olmak üzere kalibrasyon gerektirir. Genel kit talimatları bunu açıklayacaktır.
Foregene'nin qPCR Mix'i ayrıca çeşitli modellerde kullanım için uygun olan ROX boyasını içerir.

Real Time PCR Kit-Taqman

Zayıf hidrojen bağı tedavisi: Zayıf hidrojen bağlarının tedavisi nispeten teknik bir konudur.Pek çok kitin kılavuzlarını kimse okumadı, ancak hiçbiri bu konudan bahsetmedi.Aslında çok önemli.Bazların kombinasyonu esas olarak hidrojen bağlarının gücüne bağlıdır.Güçlü hidrojen bağları normal amplifikasyondur ve zayıf hidrojen bağları spesifik olmayan amplifikasyona yol açar.Zayıf hidrojen bağları iyi bir şekilde ortadan kaldırılamazsa, spesifik olmayan amplifikasyondan kaçınılamaz.Yazar kapsamında, sadece birkaç şirket bu sorunu fark etti.Kiti satın aldığınızda, seçmek istediğiniz kit için bu konuda bir çözüm düşünüp düşünmediğinize başvurabilirsiniz.

reaksiyon hacmi: 20-50ul sistemi daha yaygın olarak kullanılır ve daha küçük hacimlerin hatalara neden olması muhtemeldir.Genel olarak konuşursak, kit talimatları PCR reaksiyon hacimlerinin kullanılmasını önerecektir.Akıllı olmayın ve maliyetlerden tasarruf etmek için daha küçük hacimler kullanın.Amacı.Üye iş yerlerinin tavsiye ettiği hacim aslında test edilmiştir ve küçük hacimlerden kaynaklanan hata sorununu çözemeyebilirler.
2. Boru plakasının üreticisi ve ürün numarası
Floresan kantitatif PCR prensibini herkes bilir.Floresan toplama esas olarak PCR tüp kapakları aracılığıyla gerçekleştirilir.PCR sarf malzemelerini seçerken iki noktaya dikkat edin: iyi ışık geçirgenliği ve alete uygun olması.Genel olarak ana akım markaların boardları ve tüpleri gayet iyi fakat adaptasyon açısından dikkatli seçim yapmanız gerekiyor yoksa enstrümanı kullanamayacaksınız.

4. Üst düzey bilgi

MIQE (8)—qPCR doğrulaması
Bu, qPCR'nin en yüksek önceliğidir!Pek çok kahraman burada kuma düştü.Tabii ki, şanslı olmanız ve üzerinde çalıştığınız genlerin basit olması da mümkündür, bu nedenle buz mağarasında rüzgar boyunca süzülürsünüz.qPCR'nin doğrulama bilgileri, verilerin güvenilirliğini test etmeyi amaçlar.Gerekli doğrulama bilgilerini şu şekilde sıralıyoruz:

1.Özgüllük testi
Hedef gen amplifikasyonunun özgüllüğü, elektroforez resminin tek bir bant olup olmadığı kontrol edilerek test edilir;sıralama doğrulaması;zirve haritasının tek olup olmadığını görmek için erime eğrisi;enzim sindirim doğrulaması ve diğer yöntemler.
Burada t'ye odaklanıyoruzErime eğrileri yöntemi kullanılarak spesifik olmayan amplifikasyon analizi.Genel olarak primerleri tasarlarken ürün fragmanının boyutunun 80-200bp aralığında olması istenmektedir ki bu da PCR ürününün erime sıcaklığını 80-85 °C aralığında yapmaktadır.Bu nedenle, çeşitli pikler varsa, diğer spesifik olmayan amplifikasyon ürünleri de olmalıdır;pik 80°C'nin altında görünüyorsa, genellikle bir primer dimer olarak kabul edilir;pik 85°C'nin üzerinde görünüyorsa, genellikle DNA kontaminasyonu veya büyük fragmanların daha spesifik olmayan amplifikasyonu olarak kabul edilir.
Not: Bazen 80°C'de yalnızca tek bir tepe noktası vardır.Şu anda, bu konsepte bağlı kalınmalıdır.Amplifikasyon sonuçlarının tümünün primer dimerler olması muhtemeldir.

Normal erime eğrisi (spesifik olmayan amplifikasyon olmadan tek pik)

Sorunlu erime eğrisi (sahte piklerin spesifik olmayan amplifikasyonu)
【Vaka Analizi】

Bir ana pik var, ancak primer dimer ciddi
Aşağıdaki şekildeki tek tepe erime eğrisi, bunun mükemmel bir deney olduğunu düşünerek gözlerinizi kolayca yanıltabilir, ancak sonuç tamamen yanlıştır.Bu sırada erime sıcaklığına bakmalıyız.Tepe sıcaklığı tamamen primer-dimer olan 80°C'nin altındadır.

Hedef parça yok, tüm primer dimerler
İşte kardeşim duramaz.Aşağıdaki resim bir pislik tarafından bana gönderilen cep telefonuyla çekilmiş bir fotoğraf.Kullandığı reaktifler, endüstride yaygın olarak kullanılan markalardır.Bir T öneki markasından başka bir T öneki markasına geçti.Bence zaten tahmin ettin.Pislik bana bağırdı: "İlk resimde kullanılan reaktif çok iyi ve pik tek.Daha sonra tavsiye ettiğiniz reaktifi kullandıktan sonra karışık piklerle ikinci resimdeki gibi olur.Beni mutsuz ettin.“
İki grafiği ayırın.İlk bakışta birinin tek tepe noktası, diğerinin ise çift tepe noktası var.Saçma, tek bir zirve elbette iyidir.Bu doğru mu?
Dou E'den daha kötüsü aşağıdaki resimdeki iki resmi koysam hemen anlayacaksınız.Aslında, bu tür bir resim bizi kolayca felç eder.Dikkatli bir analizden sonra şunları bulduk: ilk şeklin tepe noktası, tamamen primer dimer olan 75°C'de;ikinci rakamın zirvesi 75°C ve 82°C'de görünüyor, en azından ürün görünüyor.

Öğrencilerden gelen geri bildirimlerin resimleri
Yani temel sorun reaktif sorunu değil, primer tasarımı sorunudur.Aynı zamanda bazı büyük markaların demir kalitesinde olmadığını da kanıtlıyor ve daha önce kardeşimin söylediğini de kanıtlıyor: Yazınızı destekleyen reaktif markası değil.Reaktiflerin markasını destekleyen makalenizdir.Bir düşünün, pislik reaktifleri değiştirmeseydi, günlüğe yanlış veriler gönderilirdi ve ne olacağı bir trajedi olurdu.
2. Kör kontrolün Ct değeri
Açıklama yapmayın, boş kontrolün Ct değeri varsa kirlilik olmaz mı?Ancak yine de hangi boş kontrolün bir Ct değerine sahip olduğunu anlamanız gerekir.NTC ise, reaktif kontaminasyonu gibi yabancı DNA olduğu anlamına gelir.NRT ise, çıkarılan RNA'nın DNA kontaminasyonu olduğu anlamına gelir.
3. Standart eğri
Eğim ve hesaplama formülü dahil olmak üzere, formül aracılığıyla PCR verimliliği hesaplanabilir.Mükemmel bir deney, standart eğrinin eğiminin 3,32'ye ve R²'nin 0,9999'a yaklaşmasını gerektirir.
4. Doğrusal dinamik aralık
Reaksiyonun dinamik aralığı doğrusaldır.Standart eğriyi oluşturmak için kullanılan şablona göre, dinamik aralık en az 5 konsantrasyon gradyanı içermeli ve yüksek konsantrasyon gradyanlarında ve düşük konsantrasyon gradyanlarında Ct değerlerinin değişimine dikkat edilmelidir.
5. Tespit doğruluğu
qPCR sonuçlarındaki değişiklikler, yani zayıf tekrarlanabilirlik, yani zayıf kesinlik, sıcaklık, konsantrasyon ve çalışma dahil olmak üzere birçok faktörden kaynaklanır.qPCR kesinliği genellikle kopya sayısı azaldıkça daha az kontrol edilebilir hale gelir.İdeal olarak deney içi varyasyon, bu teknik varyasyon biyolojik varyasyondan farklı olmalıdır ve biyolojik kopyalar, gruplar veya tedaviler arasındaki qPCR sonuçlarındaki istatistiksel farklılıkları doğrudan ele alabilir.Özellikle tanısal testler için, sahalar ve operatörler genelinde en iyi testler arası kesinlik (tekrarlanabilirlik) rapor edilmelidir.
6. Tespit verimliliği ve LOD (multipleks qPCR'de)
LOD, tespit edilen pozitif numunelerin %95'inin en düşük konsantrasyonudur.Başka bir deyişle, bir dizi hedef gen replikası içinde bulunan LOD konsantrasyonu, başarısız reaksiyonların %5'ini geçmemelidir.Özellikle nokta mutasyonlarının veya polimorfizmlerin eşzamanlı tespiti için multipleks qPCR analizi yaparken, multipleks qPCR'nin aynı tüpte çoklu hedef fragmanlarının doğruluğunun tehlikeye atılmadığına dair kanıt sağlaması gerekir, çoklu tespit ve tek tüp tespiti Verimlilik ve LOD aynı olmalıdır.Özellikle yüksek konsantrasyonlu hedef genler ve düşük konsantrasyonlu hedef genler aynı anda amplifiye edildiğinde bu soruna dikkat edilmelidir.
Sorunlar ve çözümlerGenel olarak konuşursak, qPCR hata ayıklamasında sıklıkla karşılaşılan problemler aşağıdaki yönlere odaklanır:
·spesifik olmayan amplifikasyon
·Zor primer konsantrasyonu seçimi ve primer-dimerlerle ilgili sorun
· Tavlama sıcaklığı yanlış
·İkincil yapı, amplifikasyon verimliliğini etkiler
spesifik olmayan amplifikasyon
spesifik olmayan amplifikasyonoluşursa, genellikle astar tasarımının uygun olup olmadığı değerlendirilir, ancak astarları değiştirmek için aceleniz yoksa, önce aşağıdaki yöntemleri deneyebilirsiniz (ilke de eklenmiştir):
· Tavlama sıcaklığını artırın – sürdürülemez zayıf hidrojen bağları yapmaya çalışın;
· Tavlama ve uzama süresini kısaltın – zayıf hidrojen bağları olasılığını azaltın;
·Astar konsantrasyonunu azaltın – gereksiz primerlerin ve hedef olmayan bölgelerin bağlanma şansını azaltın;
Düşük amplifikasyon verimliliği
Spesifik olmayan amplifikasyonun tersi durum – düşük amplifikasyon verimliliği ve düşük amplifikasyon verimliliği ile başa çıkmak için önlemler tam tersidir:
· Tavlama ve uzama süresini uzatır;
·Üç aşamalı PCR'ye geçin ve tavlama sıcaklığını düşürün;
· Primer konsantrasyonunu artırın;
Ps: 90'larda doğan birçok lisansüstü öğrenci, deneylerde nasıl hata ayıklanacağını inceleme konusunda isteksizdir ve kitin sorunu tamamen çözebileceğini umar (mezun olduktan sonra araştırma ve geliştirme yapmak için bir reaktif şirketine gitmek istiyorsanız), aslında, reaktif üreticileri de bu şekilde düşünüyor, umarım bu bir aptaldır.Sorunu kolayca çözmek için aptallar, zayıf hidrojen bağlarını emen bir faktör olup olmadığını görmek için reaktif şirketinin tanıtımını okumalıdır.
Zor primer konsantrasyonu seçimi ve primer-dimerlerle ilgili sorun
Yöntem 1: Genel olarak konuşursak, qPCR için kit talimatlarında önerilen sistemler ve önerilen primer konsantrasyonları bulunur.
Yöntem 2: Primer konsantrasyon gradyanını ayarlayarak hata ayıklama.Aşağıdaki resim göstermek için bir şirketten çalınmıştır.Aşağıdaki şekil, üç primer konsantrasyon gradyanı (100nM, 250nM, 500nM) ve dört şablon konsantrasyon gradyanı (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ile yapılan floresan kantitatif sonuçlarını göstermektedir.Deneysel sonuçların Ct değeri aşağıdaki gibi çizilir:

Primer Konsantrasyon Seçimi Her primer konsantrasyonunu aşağıdaki gibi bir çizgide birleştirin:

Primer konsantrasyonu seçimi açıktır, 100nM ve 250nM primer konsantrasyonunun lineer ilişkisi daha iyidir ve 500nM primer konsantrasyonunun lineer ilişkisi nispeten zayıftır.100nM ve 250nM'de, 250nM'nin Ct değeri nispeten küçüktür, dolayısıyla optimal primer konsantrasyonu 250nM'dir.Genellikle şiddetli primer-dimerler erime eğrisinde görülebilir.Ya tasarlanan primerler, primer-dimerleri önleyemezse?
Yöntem 3: Primer miktarını azaltın ve tavlama sıcaklığını artırın (açıklamaya gerek yok).
Tavlama sıcaklığının ampirik değeri 60°C'dir.Emin değilseniz, daha uygun bir tavlama sıcaklığı nasıl seçilir?Cevap, primer konsantrasyonu seçimi ile aynıdır –gradyan testi.Sorunu göstermek için Bio-rad şirketinden bir fotoğraf çekin.Belirli bir hedef parçanın amplifikasyonu için, her biri üç tekrarlı sekiz sıcaklık gradyanı ayarlayın ve elde edilen amplifikasyon eğrisi aşağıdaki gibidir:

tavlama sıcaklığı seçimi:
·70°C, 69°C—Temel olarak, primerler birleştirilemez, dolayısıyla amplifikasyon olmaz.
·67.3°C – Başlangıçta az miktarda amplifikasyon vardır ve Ct değeri nispeten büyüktür.
·64.5°C——Ct değeri düşer.
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C ve 55.0°C'de, Ct değerleri temel olarak sabit olma eğilimindeydi, ancak nihai floresans değerleri farklıydı.
Nasıl seçilir?Prensip: İlk prensip, Ct değerinin daha yüksek olmasıdır.Aynı Ct değeri için, dimerizasyon ve spesifik olmayan amplifikasyondan kaçınmak için daha yüksek bir tavlama sıcaklığı seçin.55°C'de daha yüksek bir floresans değeri olmasına rağmen, içinde dimerler veya spesifik olmayan amplifikasyon olabilir.
Ancak sizin kadar akıllıysanız, kesinlikle şunu düşüneceksiniz: Mantıksal olarak, eğer PCR reaksiyonu çok spesifikse, primer konsantrasyonu minimum gereksinimi aştığı sürece, yüksek ve düşük noktaların etkisi olmamalıdır, tıpkı floresan boyalar ve dNTP'ler gibi.Gerçekten de, tavlama sıcaklığı uygun şekilde optimize edildiği sürece, primer konsantrasyonunun Ct değeri üzerindeki etkisi doğal olarak en aza indirilecektir.

Tavlama sıcaklığı uygun şekilde optimize edilir ve primer konsantrasyonunun CT üzerindeki etkisi en aza indirilir
İkincil yapı amplifikasyon verimliliğini etkiler
Sorunu göstermek için Bio-rad'dan resim çekelim.Aynı zamanda, ikincil bir yapıya sahip bir geni büyütmek için bir sıcaklık gradyanı tasarlar.

İkincil yapı ortaya çıkıyor
Sıcaklık gradyanı azaldıkça ürünlerin ortaya çıkmaya başladığı ve Ct değerinin ileriye doğru hareket ederek 60.7°C'de minimum değere ulaştığı ve daha sonra sıcaklık gradyanı azaldıkça Ct değerinin büyüdüğü görülmektedir.Tersine, sıcaklık arttıkça ikincil yapı açılır ve amplifikasyon verimliliği artar.Belirli bir sıcaklığa ulaştıktan sonra, sıcaklığın arttırılması amplifikasyon verimini iyileştiremez.Çünkü primerler şu anda stabil bir şekilde birleştirilemez.Öyleyse,en düşük Ct değerine sahip sıcaklığı arayın, ikincil yapı şablonunu yükseltmek için en iyi sıcaklıktır!Elbette akıllı aptallar, gerekli değilse primerleri değiştirmenin ve ikincil yapı bölgesinden kaçınmanın en iyisi olduğunu bilmelidir.
5. Uygulama düzeyi
MIQE—Veri Analizi

Veri analizi esas olarak floresan kantitatif PCR cihazı tarafından verilir.Bir önceki yazıda deney tasarımında anlatılan boş kontrol gibi birçok veri analizi çalışması yapılmıştır.Dahili referans genler, tekrar sayıları vb. netleştirildi., burada esas olarak qPCR uygulamasını açıklıyoruz.
qPCR yaygın olarak kullanılmaktadır ve deneysel doğrulama ve nükleik asit teşhisi en sık kullanılan senaryolardır.
mutlak ölçüm
Günlük (ilk konsantrasyon), döngü sayısı ile doğrusal bir ilişkiye sahiptir.İlk kopya sayısı bilinen bir standarttan standart bir eğri çizilebilir, yani amplifikasyon reaksiyonunun doğrusal ilişkisi elde edilebilir.Numunenin Ct değerine göre numunedeki konsantrasyon hesaplanabilir.Eklenecek şablon miktarı.

Mutlak Kantitatif Hesaplama Yöntemi
Mutlak kantifikasyon, standart eğriye dayalı olmalıdır.Standart bir eğri oluşturmak için bir standart gereklidir.Genellikle standart, hedef genin klonlanmasıyla elde edilen bir plazmittir.Neden bir plazmittir?Çünkü dairesel plazmit DNA en kararlı olanıdır.Standart ürünü, ikiye katlama oranına (10 kat seyreltme) göre 5 ila 6 gradyan halinde seyreltin ve seyreltirken homojenliğe dikkat edin.Ct değeri 15-30 arasına düşsün.

standart hazırlık
Aynı zamanda test edilecek numune de buna göre seyreltilmelidir (seyreltme faktörünü unutmayın) ve Ct değeri de 15-30 arasına düşmelidir.Standart ürün + test edilecek numune birlikte makineye konur.Çalışmanın ardından, standart madde ile standart bir eğri yapıldı ve test edilecek numuneler, konsantrasyonu hesaplamak için standart eğriye getirildi.
Hepatit B virüsü HBV kantifikasyonu, 1 ml kandaki virüs kopya sayısını hesaplayabilen tipik bir mutlak kantifikasyondur.
Kopya sayısının hesaplanması
Test edilecek numune konsantrasyonu (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilüsyon faktörü
Numune moleküler ağırlığı = baz sayısı × 324
Test edilecek numunenin kopya sayısı (kopya/ul) = test edilecek numunenin konsantrasyonu / numunenin moleküler ağırlığı × 6 × 1014

Kopya numarası hesaplama yöntemi

Yukarıdaki miktar belirlemek için hesaplama yöntemidir.Bu, ortaokuldan mezun olduktan sonra çözülebilen bir matematik problemidir ve matematik problemleri genellikle bilgisayarlar tarafından çözülür.Anlamadıysanız, iletişim kurmak için gelebilirsiniz.
göreceli ölçüm
Göreceli ölçüm, çoğunlukla bilimsel araştırmalarda kullanılır.1 ml kanda kaç virüs vardır ve bu bir DNA virüsüdür, bu nispeten deterministik bir olaydır: kan miktarı belirlenebilir ve DNA virüsü nispeten kararlıdır.Bununla birlikte, bir yapraktaki belirli bir genin transkripsiyon kopyalarının sayısını karşılaştırmak bizim için zordur, çünkü yaprağın boyutunu, ağırlığını ve hassasiyetini belirlemek zordur, ekstrakte edilen RNA miktarını belirlemek zordur ve ters transkripsiyonun etkinliğini belirlemek de zordur yani herhangi bir adım, deneysel verilerin hatalara sahip olmasına ve kullanılamamasına neden olabilir.
Bu nedenle, göreli miktar tayini bir unsuru ortaya koymalıdır:dahili referans geni.
Başka bir deyişle, göreli kantifikasyon aslında hedef gen ile dahili referans gen arasındaki bir karşılaştırmadır.Aynı doku ve aynı hücrede karşılaştırıldığında, numune boyutunun, RNA ekstraksiyon miktarının, ters transkripsiyon verimliliğinin ve PCR verimliliğinin etkisi nispeten küçüktür.Küçük numune boyutu nedeniyle, hem dahili referans genler hem de hedef genler nispeten azaltılmıştır.Bu nedenle daha önce tekdüzelik ve istikrar üzerinde durduk.
İç referans genleri genellikletemizlik genleriTüm hücrelerde kararlı bir şekilde eksprese edilen bir gen sınıfına atıfta bulunan (ev sahibi genler) ve bunların ürünleri, hücrelerin temel yaşam aktivitelerini sürdürmek için gereklidir.
Bu kavramı karıştırmayın.Temizlik genleri biyolojik işlev terimleridir, dahili referans genleri ise deneysel teknik terimlerdir.Temizlik genlerinin dahili referans genler olarak seçilmeden önce doğrulamayı geçmesi gerekir.
Örneğin, farklı doku hücrelerinde ekspresyon seviyelerini test etmek için aşağıdaki şekilde birkaç temizlik geni seçtik ve β-2-mikroglobulinin ekspresyon seviyelerinin diğer üç geninkinden oldukça farklı olduğunu bulduk, bu nedenle dahili referans genleri olarak kullanılamayacaklardı.

İç referans geninin düzeltme işlevini anladıktan sonra, iç referans geninin eklenmesi nedeniyle iki algoritma türetilir.
· çift standart eğri yöntemi
·2 – △△Ct yöntemi (CT değeri karşılaştırma yöntemi)
Türleri ve gen fonksiyonlarını incelemekle ilgileniyorsanız, lütfen algoritma araştırmasını bırakın ve doğrudan formülleri kullanın veya doğrudan makineleri kullanın;matematik ve mühendislikte heteroseksüel biriyseniz, lütfen çekinmeyin.
çifte standart eğri yöntemi
Kontrol örneğinin ve test edilecek örneğin hedef genini ve temizlik genini standart eğri aracılığıyla ölçün ve ardından bağıl ifade düzeyi olan hesaplama formülüne göre göreli değeri hesaplayın.
Avantajları: basit analiz, nispeten basit deneysel optimizasyon
Dezavantaj: Her gen için, her deney turu standart bir eğri oluşturmalıdır.
Uygulama: Gen ifadesi regülasyonu çalışmasında en sık kullanılan ve tanınan iki göreceli kantitatif yöntemden biri
Formül aşağıdaki gibidir:

Örnekler aşağıdaki gibidir:

Kantitatif sonuca göre bağıl miktarı hesaplayın
2 – △△Ct yöntemi (CT değeri karşılaştırma yöntemi)

Avantajları: Standart bir eğri yapmaya gerek yok
Dezavantajlar: Amplifikasyon veriminin %100'e yakın olduğu varsayılır;standart sapma < %5'tir ve standart eğri ile her amplifikasyon arasındaki etkinliğin tutarlı olduğu varsayılır;deneysel koşulların optimizasyonu daha karmaşıktır.
Uygulama: Gen ifadesi regülasyonu çalışmasında en sık kullanılan ve tanınan iki göreceli kantitatif yöntemden biri

Elbette, amplifikasyon verimliliğinin mükemmel olması genellikle imkansızdır 1. Düzeltme yöntemi: Hedef genin ve referans genin aynı amplifikasyon verimliliğine sahip olduğunu biliyorsak, ancak amplifikasyon verimliliği 1'e eşit değilse, o zaman 2－△△Ct şu şekilde düzeltilebilir: (1+E )－△△Ct, örneğin amplifikasyon verimliliği 0,95 ise, o zaman hesaplama formülü 1,95'e düzeltilebilir －△△Ct
Şimdiye kadar floresan kantitatif PCR ile ilgili içeriğimiz sona ermiştir.